Cómo diseñar cebadores de PCR cuantitativos de fluorescencia del método sybrgreen La PCR cuantitativa de fluorescencia consiste en rastrear la fluorescencia de cada paso de la PCR en tiempo real a través de un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia (como ABI 7500, stepone, ROChe LightCycler, Bio-Rad CFX96, etc.) El valor de la señal cuantifica la cantidad de plantilla inicial. Además de una instrumentación estable, una enzima Taq de alta calidad y una plantilla de buena calidad, las reacciones de PCR cuantitativa exitosas también requieren pares de cebadores de alta calidad. El requisito previo para conseguir pares de cebadores de alta calidad es un excelente diseño de cebadores. A continuación tomaremos la IL6 humana como ejemplo (utilizando la secuencia de ARNm del gen IL6 humano como plantilla para diseñar cebadores) para ilustrar cómo diseñar cebadores de alta calidad. (1) Utilice la base de datos NCBI para buscar secuencias de genes. Inicie sesión en la página de inicio oficial del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Seleccione la columna "Gen", ingrese la palabra clave "IL6 homo", como se muestra en la figura siguiente, y haga clic en "Buscar". (2) Los resultados son los siguientes. Generalmente, el primer gen es el gen que desea consultar. Aquí debe prestar atención a la columna "alias", porque muchos genes tienen muchos alias, por lo que debe prestar atención a. consulta. Después de identificar el gen, haga clic para ingresar a la página de inicio del gen IL6 humano. Shanghai Jerry Bioengineering Co., Ltd. (3) Después de ingresar a la página de inicio del gen IL6 humano, baje la página y vea la siguiente interfaz. Dado que la plantilla del cebador es ARNm, necesitamos encontrar la información de transcripción del gen. Haga clic en "Detalles de la secuencia de referencia". (4) Se obtiene la siguiente interfaz. Puede ver que el gen IL6 humano tiene 2 transcripciones en los registros NCBI. Al diseñar cebadores, a menos que necesite detectar una transcripción específica, el enfoque general es comparar y analizar las secuencias de todas las transcripciones. del gen, descubra su región de secuencia **** y seleccione la región **** como plantilla para diseñar cebadores, de modo que los cebadores puedan amplificar todas las transcripciones del gen tanto como sea posible. El objetivo del diseño de cebadores es amplificar al máximo toda la información del ARNm del gen. Para el gen IL6, hicimos clic en "NM_000600.4" y "NM_001318095.1" para abrir la información de estas dos transcripciones. Shanghai Jerry Bioengineering Co., Ltd. (5) Se puede ver que las dos transcripciones del gen IL6 humano tienen diferentes tamaños, 1197 pb y 1006 pb respectivamente. Copiamos estas dos secuencias de ARNm en un software de alineación (como BIOEDIT) y las utilizamos. Se realizó el software de análisis comparativo de estas dos secuencias. (6) Los resultados de la comparación son los siguientes. A partir de los resultados de la comparación, las dos secuencias son consistentes. Sólo falta la transcripción 2 en 141-331 pb. Seleccionamos la secuencia de 331 pb-1197 pb como diseño de plantilla de Shanghai Jerry Bioengineering Co., Ltd. Imprimaciones. (7) Copie la secuencia sangrienta existente en el software de diseño de cebadores. Existen muchos programas de diseño de cebadores, como Primer premier6.0, Oligo7.37, Primer3 en línea, Beacon Designer, NCBI Primer-BLAST en línea, etc. Los principios de funcionamiento de diferentes programas de diseño de cebadores son similares y básicamente todos tienen los principios básicos del diseño de cebadores (que se enumerarán más adelante). Sin embargo, los resultados del cálculo de los valores de Tm del cebador mediante diferentes software pueden ser diferentes, lo cual es así. principalmente relacionado con el método de cálculo. Jerry Bio ofrece servicios gratuitos de diseño de cebadores. El software de diseño utilizado se desarrolla de forma independiente y ejecuta ePCR (PCR electrónica) dentro de la empresa. Tiene una función BLAST de cebador y puede seleccionar el par de cebadores óptimo. A continuación se utiliza NCBI Primer-BLAST en línea como ejemplo para ilustrar el proceso de diseño del cebador. (8) Abrir NCBI Primer-BLAST en línea. Copie la secuencia en la ubicación que se muestra en la imagen a continuación. Seleccione el mínimo "80" y el máximo "250" en "Tamaño del producto PCR" (trate de no hacer que el producto sea demasiado grande para garantizar la eficiencia de la amplificación por PCR).
(Seleccione el mínimo "80" y el máximo "250" en "Tamaño del producto de PCR" (trate de no hacer que el producto sea demasiado grande para garantizar la eficiencia de la amplificación por PCR). En el campo Base de datos, seleccione la base de datos de ARNm (el valor predeterminado es Refseq ARNm). En la columna "Biología", seleccione la especie como humana (normalmente el valor predeterminado es Homo sapiens). Una vez completadas todas las configuraciones, haga clic en "Obtener cebadores". Las siguientes opciones aparecerán después de Shanghai Jerry Bioengineering Co., Ltd. (9) se abre, debe observar si la secuencia pertenece a la secuencia del gen que desea diseñar, haga clic en "Enviar" aquí (10) y obtendrá los siguientes resultados, que proporcionan las posiciones de los cebadores ascendentes y descendentes del diseño. cebadores, los parámetros del par de cebadores específicos y los parámetros del par de cebadores resultados de ePCR Para determinar si un par de cebadores es teóricamente de alta calidad, se deben examinar los siguientes aspectos: los valores de Tm de los cebadores. consistente y lo más cercano posible a 60; los cebadores no contienen dímeros en horquilla, etc., el producto de ePCR es lo más uniforme posible y no contiene productos no específicos, etc. Los resultados se muestran en la siguiente figura. El paso es enviar la secuencia del cebador a la empresa de síntesis de cebadores para su síntesis. Después de recibir el producto terminado, realice una verificación previa de acuerdo con las instrucciones del instrumento y el kit para verificar la calidad del cebador, incluso si el par de cebadores es. bien seleccionados, solo a través de experimentos reales podemos estar 100% seguros de si el par de cebadores se puede utilizar. Al realizar experimentos de PCR cuantitativa de fluorescencia, es muy importante probar la eficiencia de amplificación de los cebadores, que discutiremos más adelante (12). Principios generales para el diseño de cebadores de PCR: la longitud del producto de PCR debe estar entre 70 y 300 pb para evitar que el producto sea demasiado largo, lo que conducirá a una disminución en la eficiencia de la amplificación de PCR y afectará los resultados cuantitativos. seleccionado en la medida de lo posible en el segmento 3' del ARNm para evitar Asegúrese de que el producto de amplificación sea toda la información del ARNm expresada por el gen. Si un gen tiene muchas transcripciones, intente asegurarse de que el producto sea toda la información del ARNm expresada por; Si un gen tiene muchas transcripciones, intente seleccionar la secuencia más completa como plantilla para diseñar cebadores para garantizar la estabilidad de los productos de amplificación. Los cebadores deben intentar evitar estructuras en horquilla, estructuras de dímeros y productos de amplificación no específicos. , valores de Tm de cebador inconsistentes, secuencias de cebador con más de 4 bases consecutivas, estructuras poli, etc. En resumen, el par de cebadores teóricamente mejor solo se puede determinar mediante verificación experimental real. En resumen, el par de cebadores teóricamente bueno solo se puede determinar. mediante verificación experimental real.