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Las bibliotecas de ADNc se pueden utilizar para analizar la estructura, expresión y regulación de genes eucariotas; comparar las diferencias de secuencia entre el ADNc y el ADN genómico correspondiente puede determinar la presencia de intrones y comprender una serie de cuestiones como el procesamiento postranscripcional. En resumen, la síntesis y clonación de ADNc se han convertido en la actualidad en herramientas fundamentales en la biología molecular eucariota. Desde la llegada de los primeros clones de ADNc a mediados de la década de 1970, se han desarrollado muchos métodos para mejorar la eficiencia de la síntesis de ADNc, los sistemas de vectores se han mejorado enormemente y los reactivos de síntesis de ADNc ahora están disponibles comercialmente. La síntesis y clonación de ADNc implica la síntesis de la primera hebra de ADNc con transcriptasa inversa, la síntesis de la segunda hebra de ADNc con polimerasa, la adición de ligaciones sintéticas y la clonación del ADN bicatenario en un vector apropiado (fago) o vector (fago). ). Los pasos básicos incluyen sintetizar la primera hebra de ADNc con transcriptasa inversa, sintetizar la segunda hebra de ADNc con polimerasa, agregar ligaduras sintéticas y clonar el ADN bicatenario en un vector apropiado (fago o plásmido). Preparación de ARN La calidad del ARNm molde afecta directamente la eficiencia de la síntesis de ADNc. Debido a las características estructurales de la molécula de ARNm, se degrada fácilmente mediante la reacción de ataque de la RNasa. Además, la RNasa es extremadamente estable y generalizada. Por lo tanto, se debe evitar la contaminación por RNasa durante el proceso de extracción y se debe suprimir su actividad. tanto como sea posible Este es el propósito de este experimento. La clave del éxito o del fracaso. Las RNasas están presentes en todos los tejidos y la piel humana, los dedos, los reactivos y los recipientes pueden estar contaminados, por lo que se deben usar guantes durante todos los experimentos y cambiarlos con frecuencia (se deben usar guantes desechables). La cristalería utilizada debe cocerse en estufa a 200°C durante más de 2 horas. Todos los materiales que no se pueden hornear a altas temperaturas, como los recipientes de plástico, se pueden tratar con una solución acuosa de pirocarbonato de dietilo al 0,1 (DEPC) y luego enjuagar con agua destilada. DEPC es un modificador químico de la RNasa que reacciona con el anillo de imidazol del grupo activo de histidina de la RNasa para inhibir la actividad enzimática. El DEPC puede producir carcinógenos cuando se mezcla con soluciones de amoníaco, por lo que se debe tener cuidado al utilizar DEPC. Los reactivos utilizados en la prueba también se pueden tratar con DEPC. Agregue DEPC a una concentración de 0,1, luego agite vigorosamente durante 10 minutos, hierva durante 15 minutos o esterilice en autoclave para eliminar el DEPC residual. De lo contrario, DEPC también se puede usar junto con adenina. Destruye la actividad del ARNm. Sin embargo, DEPC reacciona con aminas y grupos sulfhidrilo, por lo que los reactivos que contienen Tris y DTT no pueden tratarse con DEPC. Las soluciones de Tris se pueden preparar en agua tratada con DEPC y luego esterilizarlas en autoclave. Si la solución preparada no se puede esterilizar en autoclave, se puede preparar con agua tratada con DEPC y, siempre que sea posible, se deben utilizar reactivos sin abrir. Además de DEPC, también se pueden utilizar isotiocianato de guanidinio, complejo de oxirribonucleótido de vainillina, proteína inhibidora de RNasa, etc. Además, para evitar la adsorción de ARNm o ADNc en las paredes de los recipientes de vidrio o plástico, todos los recipientes deben estar silanizados. Existen muchos métodos para preparar ARN celular total, como el método de fenol caliente con isotiocianato de guanidina. El ARN total está disponible en muchas empresas. El ARNm se puede aislar aprovechando el hecho de que el extremo 3' del ARNm contiene poli(A). Cuando el ARN fluye a través de la columna de oligo(dT)celulosa, bajo la acción del tampón con alto contenido de sal, se forma el ARNm. se adsorbe específicamente en la columna de oligo (dT) celulosa) en celulosa, luego reduzca gradualmente la concentración de sal para la elución y luego reduzca gradualmente la concentración de sal de la columna de celulosa.
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