¿Cuál es la composición del medio de cultivo utilizado en experimentos microbiológicos?

1 Finalidad

1.1 Comprender y dominar los métodos de preparación y envasado de medios de cultivo

1.2 Dominar diversos métodos y técnicas de esterilización de laboratorio.

2 Principio

El medio es una mezcla de nutrientes para el crecimiento, reproducción y metabolismo de los microorganismos. Dado que los microorganismos tienen diferentes tipos nutricionales y diferentes requisitos de nutrientes, y los propósitos de los experimentos y las investigaciones son diferentes, existen muchos tipos de medios de cultivo y las materias primas utilizadas también son diferentes. Sin embargo, desde una perspectiva nutricional, los medios de cultivo generalmente contienen. los nutrientes necesarios para los microorganismos Carbono, nitrógeno, sales inorgánicas, factores de crecimiento y agua, etc. Además, el medio de cultivo también debe tener un valor de pH adecuado, una determinada capacidad tampón, un determinado potencial redox y una presión osmótica adecuada.

El agar es una sustancia coloidal que se extrae de algas como las de roca y es el coagulante más utilizado. El medio de cultivo hecho de agar se funde a 98~100 ℃ y se solidifica por debajo de 45 ℃. Sin embargo, después de repetidas fusiones, su solidificación disminuirá.

Cualquier medio de cultivo debe esterilizarse completamente a tiempo después de su preparación para prepararlo para un cultivo puro. Generalmente, los medios de cultivo se esterilizan mediante un autoclave.

3 Materiales

3.1 Herramientas y materiales

Balanza, papel para pesar, cuchara torcida, papel para prueba de pH de precisión, probeta medidora, vaso esmaltado graduado, tubo de ensayo, Matraz Erlenmeyer, embudo, rejilla dispensadora, pipetas y pipetas, placas de Petri y cajas de placas de Petri, varillas de vidrio, vasos de precipitados, soportes para tubos de ensayo, cestas de alambre, tijeras, lámparas de alcohol, algodón, cuerda, papel kraft o periódico, gasas, tubos de látex, estufas eléctricas, gabinetes de desinfección y hornos.

3.2 Reactivos farmacéuticos

Peptona, extracto de ternera, NaCl, K2HPO4, agar, NaNO3, KCl, MgSO4, FeSO4, sacarosa, maltosa, xilosa, glucosa, galactosa, lactosa, Zumo de patata , medidor de brotes de soja, fosfato de amonio, solución de NaOH al 5%, solución de HCl al 5%.

4 Proceso

Pesar el medicamento → disolver → ajustar el valor de pH → derretir el agar → filtrar y empaquetar → envolver y etiquetar → esterilizar → configurar una pendiente o verter un plato.

5 pasos

5.1 Preparación del medio de cultivo

5.1.1 Pesaje de fármacos

Pesar con precisión cada fármaco según la fórmula del medio de cultivo Haga crecer el medicamento y póngalo en un vaso de precipitados del tamaño adecuado sin agregar agar. La peptona absorbe la humedad fácilmente, así que pésala rápidamente.

5.1.2 Disolución

Utiliza una probeta para tomar una determinada cantidad de agua destilada (aproximadamente la mitad de la cantidad total) y viértela en un vaso de precipitados, caliéntala. una estufa eléctrica de malla de amianto a fuego lento remueve con una varilla de vidrio para evitar que el líquido se desborde. Cuando varios medicamentos se disuelvan por completo, deje de calentar y reponga agua. Si hay almidón en la fórmula, primero haga una pasta con el almidón con una pequeña cantidad de agua fría, caliéntelo y revuelva al fuego, luego agregue suficiente agua y otras materias primas, y agregue más agua después de que se haya disuelto por completo.

5.1.3 Ajustar el valor de pH

De acuerdo con los requisitos de valor de pH del medio de cultivo, utilice una solución de NaOH al 5% o HCl al 5% para ajustar al valor de pH requerido. Se puede utilizar el valor de pH. Mida el pH con papel de prueba o acidímetro.

5.1.4 Agar disuelto

A los medios de cultivo sólidos o semisólidos se les debe añadir una determinada cantidad de agar. Después de agregar el agar, colocarlo en la estufa eléctrica, remover y calentar hasta que el agar se derrita por completo, dejar de remover y agregar agua (es necesario precalentar el agua). Tenga cuidado de controlar el calor para evitar que el medio de cultivo se desborde o se queme.

5.1.5 Embalaje del filtro

Primero, instale el dispositivo de filtrado (Figura 3-1). Si es un medio líquido, puedes poner una capa de papel de filtro en el embudo de vidrio. Si es un medio sólido o semisólido, puedes poner varias capas de gasa en el embudo, o intercalar una fina capa de algodón absorbente. entre las dos capas de gasa y filtrar mientras esté caliente. Después de la filtración, el medio debe dividirse en alícuotas inmediatamente. Al dispensar, tenga cuidado de que el medio de cultivo no entre en contacto con la boca del tubo o botella para evitar empapar el tapón de algodón y provocar contaminación. La altura del líquido debe ser aproximadamente 1/4 de la altura del tubo de ensayo. El llenado sólido es 1/5 de la altura del tubo de ensayo y el llenado semisólido es generalmente 1/3 de la altura del tubo de ensayo. Al llenar el matraz Erlenmeyer, el volumen de llenado no debe exceder la mitad del volumen del tubo de ensayo. Matraz Erlenmeyer.

5.1.6 Etiqueta de empaque

Después de empacar el medio de cultivo, se debe empacar con tapones de algodón o tapas de tubos de ensayo, luego envolver con una capa de papel resistente a la humedad y atar. con cuerda de algodón. Marque el nombre del medio, el grupo de preparación y el nombre, la fecha, etc. en el papel de embalaje.

5.1.7 Esterilización

Los medios de cultivo anteriores deben esterilizarse a tiempo de acuerdo con las condiciones especificadas en la fórmula del medio de cultivo. El medio de cultivo ordinario se esteriliza a 121 °C durante 20 minutos para garantizar el efecto de esterilización y no destruir los ingredientes activos del medio de cultivo. Si el medio de cultivo esterilizado requiere un medio de cultivo sólido inclinado, colóquelo en la pendiente inmediatamente después de la esterilización (Figura 3-2). La longitud de la pendiente generalmente no es más de la mitad de la longitud del tubo de ensayo; -el medio de cultivo sólido se condensa verticalmente después de la esterilización en agar profundo semisólido.

5.1.8 Vierta la placa

Enfriar el medio de cultivo que se va a sembrar a 45~50 ℃ en un baño de agua y verter la placa inmediatamente.

5.2 Esterilización

La esterilización se refiere a matar o eliminar todos los microorganismos en un ambiente determinado. Los métodos de esterilización se dividen en dos categorías: esterilización física y esterilización química. Este experimento introduce principalmente uno de los métodos físicos, a saber, la esterilización por calor.

La esterilización por calor incluye la esterilización por calor húmedo y la esterilización por calor seco. Las proteínas bacterianas se coagulan y desnaturalizan mediante calentamiento para lograr la esterilización. La desnaturalización por coagulación de las proteínas está relacionada con su propio contenido de agua. Cuanto mayor es el contenido de agua, menor es la temperatura requerida para la coagulación. A la misma temperatura, el efecto de esterilización del calor húmedo es mejor que el del calor seco, porque en el caso del calor húmedo, las bacterias absorben agua, lo que hace que la proteína sea fácil de coagular, al mismo tiempo, el poder de penetración del calor húmedo es mayor; Fuerte, lo que puede mejorar el efecto de esterilización.

5.2.1. Esterilización con vapor a alta presión

La esterilización con vapor a alta presión se utiliza ampliamente y tiene una alta eficiencia de esterilización. Es el método de esterilización más utilizado en experimentos microbianos. Este método de esterilización está diseñado basándose en el principio de que el punto de ebullición del agua aumenta con el aumento de la presión del vapor. Cuando la presión del vapor alcanza 1,05 kg/cm2, la temperatura del vapor de agua aumenta a 121 °C y varios microorganismos y sus esporas o esporas en los artículos de la olla pueden morir en 15 a 30 minutos. Con este método se pueden esterilizar medios de cultivo generales, cristalería, muestras infecciosas, ropa de trabajo, etc. (Figura 3-4).

5.2.1.1 Los métodos de operación y precauciones son los siguientes

Llenado de agua

Abra la tapa de la olla de esterilización y agregue agua a la olla hasta el nivel del agua. Lo mejor es utilizar agua hervida en una olla esterilizadora vertical para reducir la acumulación de sarro en la olla. Tenga cuidado de agregar suficiente agua para evitar que la olla se seque durante el proceso de esterilización.

Cargar y cubrir

Después de cargar los materiales de esterilización, cubra la tapa de la olla de esterilización y apriete los tornillos de la tapa de manera uniforme en diagonal para que la vaporera sea hermética.

Escape

Abra el puerto de escape (también llamado válvula de purga). Use una estufa eléctrica para calentar el agua. Después de que el agua hierva, el vapor de agua y el aire se descargarán juntos por el orificio de escape. Cuando se descargue una gran cantidad de vapor, manténgalo durante 5 minutos para descargar completamente el aire frío en el. olla.

Presionar, presurizar, presurizar

Cuando se agota el aire frío de la olla, se puede cerrar la válvula de escape y la presión comienza a subir. Cuando la presión aumente a la presión requerida, controle el voltaje para mantener una temperatura constante y comience a calcular el tiempo de esterilización cuando el tiempo alcance el requisito (la esterilización general de los medios de cultivo y los vasos se controla a 121 °C, 20 minutos). deje de calentar y espere hasta que la presión baje. Cuando esté cerca de "0", abra la válvula de escape. Tenga cuidado de no expulsar el aire demasiado pronto o demasiado rápido; de lo contrario, la presión en la botella caerá más lentamente que la presión en la olla, lo que provocará que el líquido de la botella salga corriendo del recipiente.

Cultivo en blanco de medio esterilizado

El medio esterilizado se coloca en una incubadora a 37°C para su cultivo. Después de 24 horas de cultivo, se producirá un crecimiento estéril y se podrá guardar para su uso posterior. ; se saca el medio inclinado e inmediatamente después del cultivo en blanco, se coloca en una pendiente; el medio de cultivo semisólido se coloca verticalmente y después del cultivo en blanco, se condensa en agar profundo semisólido.

5.2.2 Esterilización por calor seco

El método de utilizar aire caliente seco para matar microorganismos se llama esterilización por calor seco. En circunstancias normales, una vez envasados ​​los artículos a esterilizar, se colocan en un horno eléctrico para hornear, es decir, se calientan a 160 a 170 °C y se mantienen durante 1 a 2 horas.

La esterilización por calor seco se utiliza a menudo para esterilizar cristalería y recipientes metálicos vacíos. Los artículos con revestimiento de goma, líquidos y medios sólidos no se pueden esterilizar con este método.

5.2.2.1 Preparación antes de la esterilización

La cristalería debe vendarse y bloquearse correctamente antes de la esterilización para garantizar que no quede contaminada por el mundo exterior después de la esterilización.

Los métodos comúnmente utilizados para envolver y bloquear la cristalería son los siguientes: los cubiertos se envuelven en papel o se colocan en un tubo de metal para cubiertos, el matraz triangular se envuelve en papel grueso en el tapón de algodón y la boca de la botella, y la cuerda de algodón se ata firmemente con un nudo vivo para evitar la esterilización. Después de que la boca del biberón esté contaminada por bacterias externas, enderece un extremo de la pajita, colóquela en el centro de la mecha de algodón y empújela suavemente en la boca del tubo. La tensión debe ser adecuada. Queme las fibras de algodón expuestas en la boca del tubo de manera uniforme y esterilícelas con una llama. Las pajitas esterilizadas se colocan en un tubo de metal para esterilizarlo. También puede usar un rollo de papel para envolverlo en diagonal hacia arriba desde la punta de la pajita. , enróllelo gradualmente, pellizque el extremo superior del rollo de papel y gírelo unas cuantas veces, y luego esterilice las pajitas envueltas juntas.

5.2.2.2 Esterilización en horno

Introducir los elementos envueltos en el horno teniendo cuidado de no colocarlos demasiado apretados para evitar dificultar la circulación del aire; el fondo interior del horno. La temperatura del horno debe ser de 160 a 170 ℃ durante 1 a 2 horas. Tenga cuidado de no subir demasiado la temperatura. Si la temperatura excede los 170 ℃, el papel y el algodón envueltos alrededor del recipiente se quemarán. Si se seca cristalería, la temperatura es de 120°C y el tiempo es de 30 minutos. Sólo cuando la temperatura baje de 60 a 70 °C se puede abrir la puerta y sacar los artículos; de lo contrario, la cristalería explotará debido a un enfriamiento repentino.

Al desinfectar con este método, no envuelva los artículos en aceite o papel encerado.

5.2.2.3 Esterilización por llama

Esterilización por llama directa, rápida y completa. Las asas de inoculación, las agujas de inoculación u otros utensilios metálicos se pueden esterilizar quemándolos directamente sobre la llama de una lámpara de alcohol hasta que se pongan rojos. Además, durante el proceso de inoculación, la boca del tubo de ensayo o del matraz también puede esterilizarse mediante la penetración de la llama.

6 Resultados

6.1 Se registraron los métodos de esterilización y las condiciones de esterilización (temperatura, presión, etc.) de varios artículos.

6.2 Intente describir el proceso y las precauciones para el autoclave.