Cómo diseñar cebadores de PCR
El diseño pretende lograr un equilibrio entre dos objetivos: especificidad de amplificación y eficiencia de amplificación. El software de análisis de cebadores intenta lograr un equilibrio entre estos dos objetivos, utilizando valores predeterminados para cada variante de diseño de cebadores. Se deben tener en cuenta algunos principios básicos al diseñar imprimadores:
1) Longitud del imprimador
La longitud del imprimador generalmente es de 18 a 30 bases. En términos generales, el factor más importante para determinar la temperatura de recocido del cebador (valor Tm) es la longitud del cebador. La siguiente fórmula se puede utilizar para calcular aproximadamente la temperatura de recocido de una imprimación.
Cuando la longitud del cebador es inferior a 20 pb: 4(G+C)+2(A+T)]-5 ℃
Cuando la longitud del cebador es superior a 20 pb: 62,3 ℃+0,41 ℃ (%G-C)-500/longitud-5 ℃
Además, existen muchos software que pueden calcular la temperatura de recocido y sus principios de cálculo también son diferentes. A veces, el valor calculado puede tener. una ligera desviación. Para optimizar la reacción de PCR, es mejor utilizar los cebadores más cortos y garantizar una temperatura de hibridación de no menos de 54 °C para una eficiencia y especificidad óptimas.
El límite superior de longitud del cebador no es muy importante, está relacionado principalmente con la eficiencia de la reacción. Debido al efecto de la entropía, cuanto más largo sea el cebador, menor será la velocidad a la que se hibrida con el ADN objetivo para formar una plantilla bicatenaria estable para que se una la ADN polimerasa.
② Contenido de GC
El contenido de G+C de una secuencia de cebador general suele ser del 40% al 60%. El contenido de GC y el valor de Tm de un par de cebadores deben ser consistentes. Si el cebador tiene una tendencia GC o AT severa, se puede agregar una cantidad apropiada de cola A, T o G, C al extremo 5' del cebador.
③Temperatura de recocido
La temperatura de recocido es 5 °C menor que la temperatura de fusión. Si el número de bases de imprimación es pequeño, la temperatura de recocido se puede aumentar adecuadamente, lo que puede mejorar la temperatura. especificidad de la PCR; si el número de bases es grande, la temperatura de hibridación se puede reducir adecuadamente para lograr la unión al ADN bicatenario. Una diferencia de 4 ℃ ~ 6 ℃ en la temperatura de hibridación de un par de cebadores no afectará el rendimiento de la PCR, pero es mejor tener la misma temperatura de hibridación de un par de cebadores, que puede variar entre 55 ℃ ~ 75 ℃.
④Evite la región de la estructura secundaria de la plantilla amplificada.
Es mejor evitar la región de la estructura secundaria de la plantilla al seleccionar fragmentos amplificados. Se puede utilizar software informático relevante para predecir y estimar la estructura secundaria estable del fragmento objetivo, lo que resulta útil para seleccionar plantillas. Los experimentos muestran que cuando la energía libre (ΔG) de la región que se va a amplificar es inferior a 58,6 lkJ/mol, la amplificación a menudo no tiene éxito. Si no se puede evitar esta región, reemplazar dGTP con 7-deaza-2'-desoxi GTP puede ayudar al éxito de la amplificación
.
5 Falta de coincidencia con el ADN objetivo
Cuando la secuencia de ADN objetivo amplificada es grande, un único cebador puede unirse a múltiples posiciones del ADN objetivo, lo que da como resultado múltiples tiras. En este momento, primero es necesario utilizar el software BLAST para la detección, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.