¿Cómo congelar el suero del que se extrae el ARN?

Recogida de muestras de tejido

1. Primero prepare el papel de aluminio o el tubo de criopreservación utilizado para envasar la muestra y utilice un marcador a base de aceite para escribir en la superficie del papel de aluminio o. tubo de criopreservación en varios lugares Número de muestra.

2. Extirpar el tejido requerido con precisión.

3. Retire el tejido fresco del cuerpo y elimine inmediatamente el tejido conectivo, el tejido adiposo y otros tipos de tejido que no sean necesarios para la investigación.

4. Enjuague las muestras en solución salina al 0,9 % sin ARNasa para eliminar las manchas de sangre y la suciedad.

5. Utilice el papel de aluminio preparado o el tubo de criopreservación para cargar y envolver el tejido y colocarlo rápidamente en nitrógeno líquido para enfriarlo.

6. Coloque la bolsa de muestra (bolsa de gasa, etc.) en nitrógeno líquido para congelarla y luego coloque el tejido enfriado con nitrógeno líquido en la bolsa de muestra (cada bolsa de muestra solo almacena el mismo tejido, cuando hay muchas muestras. Debe dividirse en varias bolsas pequeñas. No coloque demasiadas muestras en una bolsa de muestras para evitar que se coloquen en el tanque de nitrógeno líquido o se saquen del tanque de nitrógeno líquido). Deje una cuerda numerada en la parte. boca de la bolsa y pegue 2 pedazos en la cuerda de papel de etiqueta (indique en la etiqueta: nombre del cliente, nombre de la muestra, número de serie, fecha, pegue 2 pedazos de papel de etiqueta para evitar que la etiqueta se caiga y cause confusión en la muestra). ), y transfiéralo rápidamente al tanque de nitrógeno líquido.

7. Rellenar el formulario de registro de muestras e indicar el nombre de la muestra, tipo de tejido, número de serie, fecha de muestreo, proceso de procesamiento de la muestra, etc.

Notas

1. Al recolectar tejido tumoral, el tejido tumoral y el tejido normal deben determinarse con la mayor precisión posible. Si es posible, tome la decisión en función de los resultados de la congelación. Informe de sección. El sitio del estudio.

2. No utilice tubos Eppendorf para almacenar muestras de tejido, ya que los tubos Eppendorf pueden explotar fácilmente cuando se extraen del nitrógeno líquido, provocando la pérdida de muestra.

3. Los pasos 2 a 5 deben realizarse lo más rápido posible en hielo. Un tiempo excesivo provocará la degradación del ARN de la muestra.

4. Si las muestras patológicas o normales recolectadas durante las operaciones clínicas no se retiran inmediatamente del quirófano para su posterior procesamiento, transfiéralas a nitrógeno líquido para su almacenamiento inmediatamente después de la resección.

2. Recolección de muestras de células y sangre

Células adherentes

1. Después de cultivar o procesar las células adherentes, retire el medio de cultivo;

2. Agregue reactivo TRIzol en una proporción de 1 ml de reactivo TRIzol por 10 cm2 de área de cultivo;

3. Utilice una punta de pipeta de 1 ml para canalizar repetidamente para que TRIzol entre en contacto con la superficie de todas las botellas de cultivo. con células. Lleve a cabo la digestión completa;

4. Transfiera a un tubo de ensayo libre de ARNasa y use una jeringa desechable para batir repetidamente las células hasta que no se vean grumos de células. La solución completa debe ser clara y no pegajoso

5. Almacenar en hielo seco o en un refrigerador a -80 ℃.

Células en suspensión

6. Después de cultivar o procesar las células en suspensión, retire el medio de cultivo;

7. Lave las células retenidas rápidamente con tampón PBS. Centrifugue para eliminar el tampón PBS;

8. Agregue el reactivo TRIzol en una proporción de 1 ml de TRIzol por cada 5 × 106 células y use una jeringa desechable para bombear repetidamente las células hasta que no se vean grumos de células. La solución es transparente pero no viscosa;

9. Conservar en hielo seco o en un frigorífico a -80 °C.

Sangre

1. Agregue un volumen igual de PBS (1x) a la sangre entera fresca a la que se le ha agregado anticoagulante y mezcle bien;

2 Transfiéralo lentamente a otro tubo de centrífuga al que se le haya agregado solución de separación de linfocitos y prepare la solución mezclada anterior por encima del nivel de la solución de separación de linfocitos (es decir, no mezcle los dos líquidos y mantenga una interfaz clara) y centrifugue a . 3000 g durante 30 minutos;

3. Utilice una pipeta para separar cuidadosamente la capa de glóbulos blancos; lave los glóbulos blancos con PBS (1x), centrifugue para recuperar los glóbulos blancos y deseche el sobrenadante.

4. Agregue 20 veces el volumen de glóbulos blancos del reactivo TRIzol, use una jeringa desechable para bombear repetidamente las células hasta que no se vean grumos de células y toda la solución sea transparente pero no viscosa; /p>

5. Colocar en hielo seco o en refrigerador a -80°C. Guardar en .

3. Proceso operativo de preparación de muestras de ARN total

1. Los reactivos y otros elementos utilizados para la extracción de ARN deben estar libres de RNasa y tratar de estar en un ambiente limpio y no ventilado. Realizar experimentos.

2. Debe utilizar un método de extracción con el que esté familiarizado o que produzca buenos resultados experimentales (como EasyExtract, TRIzol o RNeasy) para la extracción de ARN.

3. Puede elegir el método de almacenamiento de ARN según las necesidades reales: las muestras de ARN que necesitan almacenamiento a largo plazo se almacenan en etanol al 75%; las muestras de ARN que no necesitan almacenamiento a largo plazo se almacenan en RNasa; -agua bidestilada libre o tampón de elución, la concentración de la muestra no debe ser inferior a 3 μg/μl (la concentración de la muestra que requiere amplificación no debe ser inferior a 0,2 μg/μl).

4. Calidad del ARN, es decir, la proporción A260/A280 debe ser de alrededor de 2. La electroforesis de ARN total requiere bandas claras de ARNr de 18 y 28, y la proporción de 28/18 debe estar por encima de 2:1. No hay diferencias significativas entre el patrón de electroforesis después de 1 hora de incubación en un baño de agua a 70°C y el patrón antes de la incubación en el baño de agua.

4. Otros métodos de procesamiento de muestras

RNAlater

1. Introducción

RNAlater es un reactivo de conservación de tejidos líquido y no tóxico. Estabiliza rápidamente el tejido y protege in situ el ARN celular no congelado. Después de obtener el bloque de tejido, se empapa rápidamente en RNAlater y se almacena sin causar degradación del ARN. Esto elimina la necesidad de procesar la muestra inmediatamente o congelarla en nitrógeno líquido para su posterior procesamiento. RNAlater debe almacenarse a temperatura ambiente y tiene una vida útil de 6 meses. Si se coloca a 4°C, se producirá precipitación. En este momento, es necesario calentarlo a 37°C para aclarar. RNAlater se puede aplicar a una amplia gama de muestras de vertebrados. Incluyendo el cerebro, el corazón, los riñones, el bazo, el hígado, los testículos, los músculos esqueléticos, la grasa, los pulmones y el timo. RNAlater también es eficaz contra E. coli, Drosophila melanogaster, células de cultivos de tejidos, células sanguíneas completas y algunas plantas. RNAlater es compatible con la mayoría de los métodos de extracción de ARN. Especialmente reactivo TRI, RNAwiz, TōTALLY RNA, RNAqueous y Poly(A)Pure.

2. Cómo utilizar RNAlater

RNAlater solo se puede utilizar en tejido fresco no se puede congelar antes de sumergirlo en RNAlater. Simplemente corte la muestra de tejido, el grosor máximo en cualquier lado no debe ser superior a 0,5 cm, y luego coloque los fragmentos de tejido en 5 veces el volumen de RNAlater y guárdelos.

Tejido animal

RNAlater no disuelve ni destruye la estructura de las muestras de tejido. Si es necesario, el tejido que se ha equilibrado en la solución RNAlater aún se puede extraer y cortar en trozos más pequeños y luego volver a colocarlo en RNAlater. Los órganos pequeños como el hígado, el riñón y el bazo de ratón se pueden conservar intactos en RNAlater.

Tejido vegetal

Muchos tejidos vegetales se pueden conservar simplemente sumergiéndolos en 5 veces el volumen de RNAlater. Es posible que las plantas con barreras naturales a la difusión, como la epidermis cerosa del tejido foliar, primero necesiten romper su barrera para permitir que RNAlater ingrese al tejido.

Células de cultivo de tejidos

Precipitar las células, lavarlas una vez con PBS, resuspender las células en una pequeña cantidad de PBS y luego añadir de 5 a 10 veces el volumen de RNAlater para su almacenamiento. .

Leucocitos

Los glóbulos blancos se pueden conservar eficazmente en RNAlater si se separan de los glóbulos rojos y del suero y se tratan como células de cultivo de tejidos. No almacene ARN de sangre total, plasma o suero en RNAlater porque tienen un alto contenido de proteínas y pueden formar precipitados insolubles cuando se mezclan con RNAlater.

Bacterias

RNAlater es bacteriostático. Aunque las bacterias no pueden crecer en RNAlater, las células aún mantienen su integridad. E. coli todavía está intacta cuando se almacena en RNAlater a 4°C durante 1 mes y produce ARN no degradado.

3. Almacenamiento de muestras en RNAlater

Almacenado a -80 ℃

Recomendado para almacenamiento por lotes. Las muestras se incubaron durante la noche a 4 °C y luego se retiraron de la solución RNAlater y se almacenaron a -80 °C. Para células de cultivo de tejidos, no es necesario retirar el RNAlater y simplemente congelar toda la solución. Los experimentos han demostrado que las células congeladas en una solución de RNAlater a -80°C no se disolvieron. Posteriormente, las muestras se pueden descongelar y volver a congelar a temperatura ambiente sin afectar la calidad o cantidad de su ARN.

Ahorro a -20℃

Recomendado para almacenamiento por lotes. Las muestras se incubaron durante la noche a 4°C y luego se transfirieron a -20°C. Las muestras no se congelarán a -20 °C, pero se formarán cristales en el tampón de almacenamiento, lo que no afecta a la extracción posterior de ARN. Posteriormente, las muestras se pueden descongelar y volver a congelar a temperatura ambiente sin afectar la calidad o cantidad de su ARN.

Almacenado a 4 ℃

Actualmente no hay evidencia de que se produzca degradación del ARN dentro de 1 mes cuando las muestras se almacenan a 4 ℃.

Si no dispones de frigorífico:

Mantén la muestra en el ambiente más frío posible. Si la temperatura ambiente supera los 25 °C, mantenga la muestra en RNAlater en hielo durante varias horas si es posible.

4. Extracción de ARN de muestras en RNAlater

Tejido

Utilice unas pinzas estériles para retirar el tejido de la solución de almacenamiento RNAlater y sumérjalo en la solución de extracción de ARN. . Una vez que el tejido se coloca en la solución de extracción de ARN, la homogeneización debe realizarse rápidamente.

Células

Existen dos métodos para extraer ARN de las células almacenadas en RNAlater: eliminando RNAlater o extrayendo ARN directamente de la mezcla de células y RNAlater.

5. Retire la muestra de RNAlater

Retire RNAlater

Debido a que la concentración de RNAlater es mayor que la de los medios de cultivo celulares típicos, generalmente es necesario sedimentar células viables. La fuerza centrífuga no puede sedimentar células en RNAlater. Centrifugar para sedimentar las células y eliminar RNAlater. (Las células HeLa requieren aproximadamente 3000 × g, pero es posible que otras células no toleren esta velocidad o requieran una mayor centrifugación).

Extraiga el ARN directamente de las células en RNAlater

como alternativa, nosotros puede purificar ARN de células sin eliminación de RNAlater utilizando soluciones de interrupción/extracción de un solo paso como TRI Reagent y RNAwiz.

Esto se puede lograr agregando 10 volúmenes de la solución de extracción de un solo paso a la mezcla de células, pero por lo demás se procede como de costumbre.

RNAsecure:

1. Introducción

RNAsecure se utiliza en lugar de DEPC en reactivos de biología molecular y tiene muchas ventajas:

1) se puede agregar a soluciones que no se pueden tratar con DEPC (como Tris o tampón MOPS);

2) se puede agregar a soluciones que no se pueden esterilizar en autoclave;

3) se puede agregar añadido a la reacción enzimática antes de añadir la enzima. Las siguientes reacciones enzimáticas en presencia del reactivo RNAsecure (agregado antes de la enzima): transcripción in vitro con ARN polimerasas T7, T3 y SP6 (37°C), transcripción inversa MMLV y AMV (42°C) y PCR SuperTaq (94°C). C), todos No se produjo inhibición enzimática.

2. Instrucciones de uso

1) Diluir el reactivo RNAsecure a 1x con tampón o solución tratada y mezclar bien.

2) Calentar la mezcla al baño maría a 60°C durante 20 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Estas soluciones pueden prepararse para la posterior extracción y análisis de ARN, o almacenarse a temperatura ambiente, 4 °C o -20 °C para uso futuro.

3) Para eliminar cualquier contaminación por RNasa que pueda ocurrir después del tratamiento inicial, la solución RNAsecure se puede volver a calentar en un baño de agua a 60 °C durante 10 a 20 minutos antes de su uso.

3. Notas

El reactivo RNAsecure solo está activo a temperaturas superiores a 45 °C, pero algunas enzimas pueden inactivarse cuando el sistema de reacción se incuba por encima de esta temperatura. Por lo tanto, cuando se trata el tampón de reacción con RNAsecure, el punto crítico antes de agregar la enzima debe usarse como punto crítico y luego la temperatura de incubación debe ser inferior a 45 °C al realizar la reacción enzimática. NOTA: Esto no funciona con la polimerasa Taq.

5. Instrumentos, reactivos y consumibles de uso común para la preparación de muestras

1. Reactivos y consumibles de uso común

DEPC

Reactivo TRIzol

Cloroformo: Alcohol isoamílico

Jeringas y agujas desechables

Kit Qiagen RNeasy Mini

Qiagen RNAlater

Ambion Reactivo RNAsecure

Punta (sin RNasa)

Tubo de microcentrífuga (sin RNasa)

2. Tratamiento sin RNasa de elementos utilizados en la preparación de muestras

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Agua libre de ARNasa: Tratar con 0,1DEPC (agitar durante la noche con un agitador magnético), esterilizar en autoclave.

Cloroformo

Etanol anhidro (marcar el nuevo paquete para uso de ARN solo después de abrir)

Etanol 75: Preparado con agua libre de ARNasa.

Remojar los tubos de centrífuga, los tubos de criopreservación y las puntas en agua 0,1DEPC durante la noche, secar y luego esterilizar en autoclave.

Otros utensilios de vidrio o metal se envuelven en papel de aluminio y se secan a 180°C durante la noche.

Cualquier operación que implique contacto con muestras requiere el uso de guantes desechables para evitar el contacto directo con las muestras.