Métodos comunes para determinar el peso molecular de las proteínas
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Método general:
Método de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS para determinar el peso molecular de las proteínas
[Principio]
El método del dodecilsulfato de sodio (Dodecilsulfato de sodio, denominado SDS) fue desarrollado por Weber y Osborn a finales de la década de 1960 basándose en los experimentos de Shapiro et al. La determinación del peso molecular de las proteínas mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida es una nueva tecnología desarrollada por Weber y Osborne a finales de la década de 1960 basada en los experimentos de Shapiro et al.
En los métodos generales de electroforesis, la movilidad electroforética de las proteínas depende principalmente de la carga neta que transportan a un determinado pH. La variabilidad del tamaño molecular (es decir, el peso molecular) y la forma está determinada por la condensación de SDS-poliacrilamida. En la electroforesis en gel, la movilidad electroforética de la mayoría de las proteínas depende principalmente de su peso molecular y no tiene nada que ver con la carga y forma originales.
El SDS es un tensioactivo aniónico, bajo ciertas condiciones, puede abrir los enlaces de hidrógeno y los enlaces hidrofóbicos de las proteínas y combinarse con estas moléculas de proteínas en proporción para formar un complejo proteína-SDS con carga negativa. generalmente se combina con 1,4 gramos de SDS. La proporción fija de SDS a proteína hace que todos los complejos proteína-SDS lleven la misma cantidad de carga negativa, que excede con creces la carga original de la proteína. La cantidad de carga negativa excede con creces la carga original de la proteína, enmascarando la diferencia de carga original entre las proteínas. En solución acuosa, el complejo proteína-SDS tiene la misma conformación, que es similar a una varilla elíptica larga en forma de cigarro (el eje corto es de 1,8 nm y el eje largo cambia proporcionalmente con el peso molecular de la proteína), lo que supera la interacción original entre proteínas diferencia de forma. De esta manera, la movilidad del complejo proteína-SDS en el gel ya no se ve afectada por la carga y la forma originales, sino que sólo depende del peso molecular de la proteína. La relación entre el peso molecular de la proteína y la movilidad electroforética se puede expresar mediante la siguiente fórmula:
lgMr = K - bm
Donde Mr es el peso molecular, K es la constante, b es la pendiente y m es la tasa de migración.
Por lo tanto, el peso molecular de una proteína determinado mediante este método sólo puede conocerse en función de su posición en la curva de movilidad lgMr~ de una proteína estándar de peso molecular conocido.
El peso molecular medido mediante este método no es el peso molecular completo de las proteínas naturales (excepto las proteínas monocatenarias), sino el peso molecular de las subunidades o cadenas peptídicas que forman estas proteínas. Este enfoque no es adecuado para ciertas proteínas con cargas inusuales, conformaciones inusuales o que contienen grandes cantidades de cofactores, como la histona F1 y ciertas glicoproteínas. Tampoco funciona con determinadas proteínas estructurales, como el colágeno.
La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS se puede dividir en electroforesis en sistema continuo SDS y electroforesis en sistema discontinuo SDS según la diferencia en el tampón, el valor de pH y el tamaño de poro del sistema de electroforesis en gel según el gel; método de forma y electroforesis, se puede dividir en electroforesis de tubo vertical de gel de poliacrilamida SDS y electroforesis de placa vertical de gel de poliacrilamida SDS.
Este experimento utiliza el método de electroforesis en placa vertical de gel de poliacrilamida-SDS. A través de este experimento, los estudiantes pueden dominar los principios y técnicas de la electroforesis en placa vertical de gel de SDS-poliacrilamida, incluida la preparación del gel, el llenado del gel, la adición de muestras, la extracción del gel, la fijación y la tinción, etc., y aprender a utilizar estos métodos para determinar el valor molecular. peso de las proteínas.
[Métodos y pasos]
I. Preparación de la solución de adición
1. Preparación de la solución de adición de proteínas estándar Pesar el citocromo y la lactasa pancreática, la pepsina, la ovoalbúmina, y albúmina sérica bovina, 0,5-1 mg cada una, se colocan en un tubo de centrífuga pequeño (tubo Eppendorf), se agrega 1 ml de solución para disolver la muestra y se disuelve por completo. Si hay materia insoluble, se debe eliminar mediante centrifugación. Calentar al baño maría hirviendo durante 3 minutos, enfriar y reservar.
2. La preparación de la solución de adición de proteínas
Depende del estado de la muestra de proteína a analizar.
(1) Sólido
Si la muestra de proteína que se va a analizar se prepara como una proteína sólida pura sin sal, el método de preparación de la solución enriquecida es el mismo que el método de preparación. de la solución estándar enriquecida con proteína; si es Para preparar una proteína sólida pura que contenga sal, debe disolverse completamente en agua, dializarse con tampón de diálisis durante 12 a 16 horas y luego pipetear 0,5 ml (la concentración de proteína debe ser 0,5-); 1mg/mL), colocarlo en un tubo Eppendorf, y luego mezclarlo con tampón de diálisis Diálisis líquida durante 12-16h. Agregue un volumen igual de solución de muestra concentrada al tubo Eppendorf, caliente en un baño de agua hirviendo durante 3 minutos y enfríe hasta que esté listo para su uso.
(2) Líquido
Si la muestra de proteína que se va a analizar es una preparación líquida de proteína pura sin sal, agregue un volumen igual de solución de muestra concentrada y luego trate con calor; es una preparación líquida que contiene sal, primero se requiere diálisis.
2. Preparación del gel
1. Preparación de la placa de gel
(1) Lavar la placa
Diluir y lavar con agua tibia. agua Use el agente, empápelo con una esponja y frote la placa de vidrio, enjuáguelo con agua del grifo y luego séquelo con alcohol.
(2) Instalación de la placa de pegamento
Antes de realizar el pegamento, alinee la placa de vidrio con el borde de la moldura de plástico y la placa de cerámica cóncava, y selle el borde inferior con una cinta selladora. Sujete ambos extremos con clips de plástico o clips de hierro, asegúrese de sellar bien y luego colóquelos en el marco fijo.
2.Preparación de gel de separación y solución de gel de concentración
Agrupación
Gel de separación/mL
Gel de concentración/mL
Solución de almacenamiento en gel
2,5
0,26
Tampón de gel separador (pH 8,8)
1,9
-
Tampón gel concentrado (pH 6,8)
-
0,5
10 SDS
0,075
0,02
TEMED
0,026
0,02
Agua de doble evaporación
3,05
1,22
10 Persulfato de amonio
0,013
0,02
Volumen total
7,6
2
Nota: ①Finalmente agregue una solución de persulfato de amonio al 10%, mézclela en una solución de gel e infunda rápidamente el gel.
②La acrilamida y la metilendioxibisacrilamida son agentes nerviosos que irritan la piel. Por lo tanto, se debe tener cuidado para evitar la inhalación y el contacto con la piel. El gel de poliacrilamida completamente polimerizado no es tóxico.
3. Prepare la solución de gel de separación
Coloque la solución de gel de separación preparada verticalmente sobre la placa de gel, inserte un peine de muestra del espesor correspondiente y marque una línea de 1 cm en el borde inferior. del peine de muestra, retire el peine de muestra. Agregue lentamente el pegamento de separación preparado entre las placas de pegamento hasta que el nivel del líquido alcance la marca. Utilice un gotero para acercarse a la interfaz del pegamento y cubra con cuidado y lentamente la capa de n-butanol con un espesor de aproximadamente 0,5 cm para evitar que el pegamento se evapore y garantizar una superficie lisa del pegamento.
4. Concentra el pegamento líquido
Separa el pegamento líquido polimerizado, vierte el n-butanol, enjuaga la superficie del pegamento líquido separado dos veces con agua destilada y usa papel de filtro. para absorber el líquido residual. Utilice un gotero para agregar la solución de gel concentrado a la superficie del gel de separación, cárguelo en una placa de gel e insértelo en el peine de muestra.
(3) Electroforesis
1. Instalación del tanque de electroforesis
Después de polimerizar el gel de apilamiento, retire el peine, la cinta selladora y seis clips de hierro. Coloque la llave para fabricar gel, el núcleo de electroforesis defectuoso y el otro conjunto de placas para fabricar gel en el tanque de electroforesis en secuencia. Las placas cerámicas cóncavas de las dos placas de gel deben estar en contacto con el núcleo interno del tanque de electroforesis. Luego inserte placas de cuña para fijar los dos juegos de placas de goma. Si solo se utiliza una placa de gel para cada electroforesis, el otro juego de placas de gel debe reemplazarse por la placa de plexiglás incluida.
2. Agregue la muestra
Inyecte solución tampón en el tanque interior y en el tanque exterior de modo que el nivel de agua en el tanque interior y en el tanque exterior supere la muesca de la placa cóncava pero sea más bajo. que el borde superior de la placa de goma. Utilice un micromuestreador para agregar muestra al orificio del peine.
3. Electroforesis
Cubra la cubierta superior y realice la electroforesis a 80 V ~ 100 V durante aproximadamente 3 horas hasta que el frente de electroforesis indicado por el azul de bromofenol llegue al borde inferior de la placa de plástico y gire. apagado. Luego retire la placa de cuña y retire la llave para pegamento.
(4) Teñido y decoloración
Utilice una cuchilla o un plato fino para separar suavemente el plato de plástico blanco y el plato de cerámica, y utilice una cuchilla para cortar el gel separador a lo largo del unión del gel de separación y el gel concentrado, y corte una pequeña esquina de la esquina superior izquierda del gel de separación para marcar el orden de las muestras. Luego póngase guantes de goma y transfiera con cuidado el gel de separación al recipiente de tinción. Agregue 100 ml de solución de tinción Coomassie Brilliant Blue (una solución acuosa que contiene 0,25 Coomassie Brilliant Blue R-250, 30 etanol y 10 ácido acético) al recipiente de tinción, cubra y tiña en una coctelera durante 2 horas.
Vierta la solución colorante nuevamente en la botella de almacenamiento (reutilizable). Agregue 100 ml de solución de tinción (10% ácido acético, 30% etanol) a la placa de tinción y agite hasta que las bandas de proteínas estén claras.
[Resultados y cálculos]
1. Después de eliminar el color de fondo del gel, las bandas son claramente visibles.
2. Traza o toma fotografías del patrón de electroforesis basándose en la muestra real.
2. De acuerdo con la relación entre la distancia de migración de cada proteína y la distancia de migración del tinte, calcule la movilidad relativa mr de cada proteína, dibuje el diagrama de relación lgMr~mr y calcule el peso molecular correspondiente. a la proteína desconocida mr del diagrama.