¿Cuáles son los sitios web de diseño de cebadores en línea? Cómo diseñar rápidamente shRNA
2022-03-16 Diseño de cebadores y verificación en línea
¿Son útiles los cebadores que diseñó? Puede hacer una PCR electrónica antes de realizar el experimento
cebador qPCR diseño Verificación en línea
Método 1: sonda NCBI
1 Anteriormente, había una opción de sonda en NCBI que puede diseñar cebadores directamente, y las secuencias ascendentes y descendentes se proporcionarán arriba. . Por ejemplo, cuando se busca el gen nanog de ratón, se obtienen dos cebadores como este:
Cebador ascendente: TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT
Cebador descendente: ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
Método 2: Primer3web
Referencia: Diseño de cebadores en línea Primer3web: ¡aprenda el diseño de cebadores minimalistas paso a paso en 2 minutos - Bilibili()
2.1. p >Tome humanp53 como ejemplo para el diseño de cebadores.
Sitio web oficial de PubMed:
Paso 1: Seleccione Nucleótido de la lista desplegable
Paso 2: Introduzca el ARNm de la especie genética (por ejemplo: p53humanmRNA)
Paso 3: Haga clic en Buscar
Paso 4: Haga clic para seleccionar (mRNA4.782) en la columna de la izquierda
Paso 5: Haga un solo clic para ingresar el primer elemento (Homosapiens_mRNA_for_P53, completecds) para el p53humanmRNA que estamos buscando
Paso 6: haga clic para seleccionar la opción CDS en Funciones
Paso 7: haga clic para seleccionar FASTA La serie CDS de este gen Aparecerá en el formato
2.2 Comience a diseñar cebadores
Sitio web oficial de Primer3web:
/
Después de ingresar al sitio web oficial de Primer3web, realice las siguientes operaciones:
Paso 1: Desplegue la entrada para seleccionar especie (HUMANA)
Paso 2: Ingrese la secuencia CDS que acaba de copiar en el cuadro de entrada
Paso 3: haga clic en PickPrimers
Paso 4: genere la secuencia de cebadores en el resultado final, hay cuatro pares de cebadores para elegir;
Elija los cebadores adecuados: ¿cómo calcular el adecuado?
Lo primero que debe tener en cuenta es que la longitud de amplificación del cebador de 100 ~ 300 pb es mejor para la amplificación;
Cebadores La longitud es preferiblemente de 20 ~ 25 pb, y la diferencia entre los cebadores ascendentes y descendentes no debe exceder los 5 pb;
Luego observe el valor de Tm, que es de alrededor de 60 ℃, y la diferencia no debe exceder 1 ℃.
Una cosa más:
Dado que los cebadores de qPCR están diseñados, deben diseñarse a través de exones, para evitar la influencia del ADN genómico en el valor de CT si no se extienden. exones, entonces el valor CT de la curva de fusión amplificada será menor. Entonces, ¿cómo saber si los cebadores que diseña están diseñados para abarcar exones?
La respuesta es que puede hacer coincidir los exones e intrones del gen en NCBI según la ubicación genómica de los cebadores que diseñó. para comparar las ubicaciones de conexión. Basta mirar la posición de unión del ARNm de ese gen.
Método 3: NCBI-BLAST-primer-blast
Una vez completado el diseño del cebador anterior, aún debe verificar manualmente si el cebador abarca el intrón, lo cual es demasiado problemático. Luego popularice un método más conveniente.
Referencia:
3.1: Encuentre la secuencia de ARNm del gen objetivo en NCBI
Abra la página principal de NCBI, seleccione GEN, ingrese el nombre del gen -" muestra muchos genes de diferentes especies pero con el mismo nombre - "Encuentre la especie que desea, abra -" muestra la información del gen, busque el NM****************** delante de "mRNAandprotein" y copie el número.
Nota: En este momento, verá mucha información de NM****, que indica las diferentes isoformas de este gen, que se pueden determinar buscando en la literatura y la explicación detrás de estas secuencias de genes. Si no estás seguro, elige generalmente el más largo.
3.2: Comience a diseñar cebadores que abarquen exones
Abra el sitio web NCBI-BLAST-primer-blast, ingrese el número de ARNm copiado arriba en el cuadro de secuencia y seleccione en el menú desplegable Elija su especie, luego seleccione Primermustspananexon-exonjunction en el cuadro desplegable Exonjunctionspan, establezca las longitudes mínima y máxima del cebador y haga clic en Getprimer. Puede saltar a la página Primer-BLASTResults. Este proceso tardará un poco, espere un momento. Una vez que aparece, hay una vista gráfica de la columna de pares de cebadores, que le indicará qué exones abarcan los pares de cebadores diseñados.
Elija el mejor par entre estos pares de cebadores que abarcan exones:
a). (Debido a que un cebador abarca un intrón, este cebador no coincidirá con el ADN genómico. Incluso si otro cebador coincide con el ADN genómico, un cebador no puede amplificar nada. Debido a que la amplificación de un cebador no puede lograr un crecimiento exponencial. Después de docenas de ciclos de amplificación, la señal está oscurecida por la señal correctamente emparejada que crece exponencialmente. Al igual que en la PCR ordinaria, si solo se agregan los cebadores ascendentes o descendentes, no saldrá absolutamente nada de la PCR porque el rendimiento es demasiado bajo. >
b). La distancia entre un par de cebadores no debe ser demasiado larga, ya que se requiere que el producto de amplificación esté entre 100 y 300 pb. Si es demasiado larga, el valor de CT será menor.
¿Qué puedes hacer para verificar el resultado de la PCR de los cebadores que diseñaste? Puedes hacer una PCR electrónica para verlo.
1.UCSC-Tools-In-SilicoPCR
Ingrese a UCSC, seleccione In-SilicoPCR de Herramientas, ingrese los cebadores ascendentes y descendentes, seleccione el ensamblaje del genoma como objetivo, haga clic en enviar o Si esto no funciona, vamos, recuerda marcar FlipReversePrimer. Porque el flujo ascendente y descendente puede invertirse. Si todo va bien después del envío, aparecerá una secuencia grande que le indicará la posición en el cromosoma y la longitud inicial y final de la secuencia producida después de completar la PCR electrónica. Luego ingrese el gen objetivo de su PCR en el. Opción del gen NCBI y eche un vistazo. Al observar la posición inicial del gen objetivo, sabrá si el resultado de la PCR es la secuencia del gen objetivo.
Nota: La secuencia producida por OCR solo puede ser parte del gen objetivo. Puedes conocerlo comparando la posición inicial de la secuencia. Debido a que los cebadores se diseñan utilizando el gen objetivo, lo que resulta de la PCR es la secuencia entre los dos cebadores.
Ingrese NCBI-BLAST-primerBLAST o ingrese directamente esta URL: Primerdesigningtool()
Ingrese los cebadores ascendentes y descendentes que acaba de diseñar en el parámetro cebador
Extraiga. baje la base de datos Seleccione RefseqmRNA para la opción
Luego haga clic en Getprimer;
Espere un momento, se atascará por un tiempo antes de que salga.
Se publicó un informe básico detallado; se escribió que ProductssonTargetTemplate son transcripciones diferentes de Homosapienstumorproteinp53 (TP53), y las longitudes de los productos también son las mismas. Esto muestra que el gen amplificado por este par de cebadores es el gen.
Las ventajas y desventajas de los dos métodos de verificación:
El método de verificación UCSC puede verificar todas las secuencias que usted amplificó.
BLAST de NCBI solo puede proporcionar las amplificadas; secuencia. Si lo amplificado es el gen que desea y la longitud del producto amplificado.
Selección: Se recomienda utilizar el método NCBI-BLAST-primer-blast para diseñar cebadores, y también utilizar el método NCBI-BLAST-primer-blast para verificar los cebadores que diseña.
Consejos para compartir tecnología para diseñar cebadores qPCR - Zhihu ()
Por ejemplo: diseñar cebadores qPCR para el gen Syt4 (ratón)
Paso 1: ingresar NCBI- GENE, encuentre el número NM***** del ARNm de este gen
paso 2: ingrese este número en el cuadro de secuencia de entrada NCBI-BLAST-primer-blast, verifique las condiciones correspondientes y limite el; Producto de PCR La longitud está entre 70 y 300; por lo tanto, se diseñaron 10 cebadores que abarcan el intrón y el segundo par de cebadores se seleccionó en función de las condiciones de Tm:
Ascendente: GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT
Ascendente : CCAACCGTCCAATCACCTCA
paso 3: Vuelva a ingresar este par de cebadores en las cajas de cebadores ascendentes y descendentes de NCBI-BLAST-primer-blast, haga clic en Obtenerprimers y descubra que el único gen amplificado por este par de cebadores es el gen Syt4. Esto muestra que este par de cebadores tiene buena especificidad.
Paso 4: ingrese UCSC-Tools--In-SilicoPCR, ingrese los cebadores ascendentes y descendentes y haga clic en Enviar. Si no hay producto después del salto, regrese y ajuste los parámetros, como los parámetros de destino, FlipReversePrimer: si se debe verificar, etc. El producto final es Syt4, de 220 pb de longitud. Esto muestra que el producto de PCR de este par de cebadores es muy específico y solo hay un producto.
Paso 5: Verificación adicional: dado que los cebadores abarcaron el intrón al diseñar el cebador, y me recordaron que el cebador anterior abarcó el intrón, ingresé NCBI-Nucleotide e ingresé: Syt4MusmusculusmRNA, hice clic en Buscar y luego Haga clic en ARNm en la columna de la izquierda y luego haga clic en el primero... Consulte el paso 2.1 anterior para encontrar la secuencia CDS de este gen. Después de encontrar la secuencia CDS, busque los dos cebadores ascendentes y descendentes y encuéntrelos en el. Región CDS, y la secuencia del producto de PCR de este par de cebadores también se encuentra en la región CDS. Después de una inspección cuidadosa, se encontró que la ubicación del cebador aguas arriba es 1203-1224, que de hecho abarca dos exones: exón1098..1218 y. exon1219..3901.
Arriba diseñamos la secuencia del cebador qPCR del gen Syt4. Puede dejar que la empresa lo sintetice directamente.
Todos los anteriores son diseños de cebadores para qPCR. Generalmente, los productos genéticos amplificados tienen solo entre 100 y 300 pb y se utilizan con fines cuantitativos o semicuantitativos. Pero si desea amplificar el ADN de longitud completa, utilice el software Primer5. La longitud del producto de amplificación la puede configurar usted mismo arriba.
Cómo utilizar el software PrimerPremier5 para diseñar cebadores de PCR - Baidu Experience () Cómo diseñar rápidamente shRNA
En el estudio de funciones genéticas, RNAi se ha convertido en un método popular porque puede silenciar genes específicamente o reducir su expresión. Una poderosa herramienta para experimentos biológicos.
Entre ellos, los vectores lentivirales de shRNA se utilizan ampliamente. Hoy les contaré dos métodos para diseñar y construir rápidamente shRNA en vectores lentivirales.
1. Sitio web de Sigma
Sigma ha creado una biblioteca de shRNA para humanos y ratones, y se han verificado las secuencias de shRNA de algunos genes, por lo que puedes usar directamente las que tiene Sigma. la secuenciación de ARNi verificada es la más conveniente.
Primero abra la URL:
, tomando Fli1 como ejemplo, ingrese el nombre del gen directamente, haga clic en buscar y aparecerá la siguiente interfaz:
Buscar y haga clic en shRNA en la opción Productos, y luego aparecerá esta interfaz:
Haga clic en PRECIOS en la línea "MISSIONshRNALentiviralTransductionParticles" y aparecerá una interfaz para mostrar el shRNA dirigido al gen objetivo:
Cuando aparezca, felicitaciones, este gen ha sido verificado por sigma. Tire hacia abajo para encontrar el shRNA verificado, que se utiliza para construir lentivirus. Es simple y efectivo, y la eficiencia de eliminación está básicamente garantizada. Si no hay un shRNA verificado, aún puede seleccionar objetivos efectivos seleccionando algunos shRNA más según sea necesario. Consejo: el editor tiende a elegir shRNA en la región CDS, y básicamente no se selecciona 3UTR, y cada shRNA seleccionado será BLASTed en NCBI para garantizar que el objetivo sea específico. Después de la comparación Blast, finalmente se confirmó que se seleccionaron los siguientes dos shRNA del gen FLI1:
Es necesario recordarle que si desea construirlo en un vector lentiviral, los cebadores de shRNA sintetizados ser diferentes dependiendo del vector. Los utilizados por sigma es el vector pLKO.1. El editor a menudo usa el vector pGreenPuro (CMV) de SBI. Los sitios de restricción en ambos extremos son BamHI/EcoRI. shRNA reemplaza la parte roja en el medio):
Sentido: GATCCCCCTTCTGACATCCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG
Antisentido: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG
2. LifeTechnologies tiene un software de diseño de shRNA en línea muy práctico que es muy fácil de operar, y el shRNA diseñado ya no necesita ser volado en NCBI y puede usarse directamente.
Primero abra el sitio web:
, seleccione shRNA en TargetDesignOptions, tome Fli1 como ejemplo, ingrese el número de acceso o la secuencia de nucleótidos, las demás condiciones permanecen sin cambios:
Desplácese hacia abajo hasta la parte inferior y haga clic en RNAiDesign, y luego aparecerán las 10 secuencias objetivo recomendadas:
De acuerdo con la clasificación de Clasificación, seleccione las que necesita (Cuihua generalmente elige 4, una para cada posición) y haga clic en DesignshRNAOligos:
Luego seleccione la secuencia apropiada en DefaultLoopSequence (el vector usado por Cuihua es pGreenPuro. Esta secuencia no es requerida, por lo que se usa de manera predeterminada. Se eliminará al sintetizar cebadores más adelante), ingrese CTCGAG en CustomLoopSequence y haga clic en Diseño:
Obtener shRNA
Recordatorio: los cebadores sintetizados deben ajustarse de acuerdo con los requisitos del vector, al igual que el diseño de sigma, corte enzimático. Los sitios deben agregarse antes y después, y finalmente ya está.
Diseño en línea del sitio web de cebadores qPCR (última fecha de actualización: 26.5.2022)
Visto por primera vez en Up Master: video sin Ct y sin banda #serie qPCR# Diseño tonto de cebadores cuantitativos Vista de especificidad de cebadores