Clonación de genes

La clonación genética o clonación molecular, también conocida como tecnología de ADN recombinante, es la aplicación de métodos enzimáticos para volver a ensamblar moléculas de ADN de diferentes fuentes en híbridos in vitro mediante corte enzimático, ligadura y otras operaciones. moléculas en células huésped apropiadas para formar una gran cantidad de moléculas de ADN de progenie. Por ejemplo, para obtener un determinado gen en el genoma humano, necesitamos utilizar tecnología de clonación de genes para aislar, clonar y amplificar el gen objetivo. Por lo tanto, a continuación presentaré la herramienta de clonación de genes y el proceso experimental específico.

(1) Endonucleasa de restricción

La primera introducción es la endonucleasa de restricción, que es un miembro importante del mecanismo de defensa bacteriano del "sistema de modificación de restricción". Sistema de Modificación de Restricción (sistema R-M), es decir, sistema de enzima de restricción y metilasa (Figura 1) [1]. Los investigadores llaman a las enzimas que pueden identificar y cortar ciertas partes de moléculas de ADN extrañas, inactivar el ADN extraño y limitar la reproducción de fagos extraños, llamadas endonucleasas de restricción (RE, denominadas endonucleasas de restricción o enzimas de restricción). Después de que la metilasa metila el ADN de la bacteria huésped, el sitio de corte de la enzima del ADN queda protegido y no será cortado por la enzima de restricción.

Según la estructura, el sitio de reconocimiento, el sitio de escisión y otras características de la endonucleasa de restricción, las RE se pueden dividir en cuatro categorías (Tabla 1) [2]. Enzima Dicer. Sin embargo, las endonucleasas de tipo IV, que pueden reconocer el ADN modificado, pueden utilizarse para la investigación epigenética.

Las endonucleasas de restricción de tipo II son el tipo de endonucleasas más comúnmente descubierto y se pueden dividir en diferentes subtipos según las características de sus sitios de reconocimiento y sitios de escisión [3]. las secuencias palindrómicas, Eco R I, pertenecen al Tipo IIP. El sitio de escisión de esta enzima está dentro del sitio de reconocimiento de enzimas como Bpi I actualmente utilizadas en la clonación de genes relacionados con CRISPR/Cas9, pertenece al Tipo IIS, y su sitio de escisión es. a varias o docenas de bases del sitio de reconocimiento.

Al tratarse de una endonucleasa de restricción, tras cortar el ADN quedarán diferentes tipos de extremos, incluidos extremos pegajosos y extremos romos (Figura 3). El llamado extremo pegajoso es el tipo de extremo que tiene un extremo 5' o una base que sobresale en el extremo 3' después de la digestión enzimática. Por lo tanto, se divide en extremo saliente 5', como Hin d III y saliente 3'. final, como Pst I. . Los que no tienen bases sobresalientes después de la digestión son del tipo de punta roma, como el Eco R V.

Las bases del ADN están conectadas por enlaces fosfodiéster 5', 3'. Después de que la enzima de restricción corta el ADN, aparecen 5'-P y 3'-OH (Figura 4).

Además, según la función de las endonucleasas de restricción, existen tipos como enzimas de isoescisión, enzimas de isoescisión, enzimas de homoescisión, enzimas variables y endonucleasas sensibles a modificaciones (Figura 5). Entre ellos, los isoesquizómeros, también conocidos como isoenzimas heterólogas, son diferentes enzimas de tipo II aisladas de diferentes procariotas y tienen las mismas características de reconocimiento y sitios de escisión, como Age I y Bsh T I. Las enzimas isosquizasas reconocen la misma secuencia de nucleótidos pero escinden el ADN en sitios diferentes, como Sma I y Xma I. Isocaudarmer se refiere a enzimas de diferentes fuentes cuyas secuencias de reconocimiento y escisión tienen una cierta correlación, y pueden producir las mismas puntas pegajosas después de su acción, como Age I y Xma I. Los productos digeridos por este tipo de enzima se pueden conectar. juega un papel importante en la clonación de genes. Una enzima variable significa que una o varias bases en la secuencia de ADN que reconoce son variables y la secuencia de reconocimiento a menudo excede los 6 pares de bases. Por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de Bst E II es: GGTNACC, donde N es una base variable. puede ser cualquiera de los cuatro tipos A/T/C/G y la secuencia de reconocimiento de Bst NI es CCWGG, donde W representa A o T;

Las endonucleasas sensibles a la modificación son endonucleasas de restricción que son sensibles a las modificaciones del ADN (como las modificaciones de metilación). Por ejemplo, Bcl I no puede cortar los sitios de reconocimiento metilados, pero puede cortar los no metilados; es todo lo contrario, solo puede escindirse si; está metilado.

Hay tantos tipos de enzimas de restricción, ¿cuál elegir?

Primero, debemos realizar un análisis del sitio de restricción. Podemos utilizar herramientas de análisis en línea (Sequence Manipulation Suite y analyse-sequence, Addgene) o de versión local (SnapGene). Luego seleccione el RE en función de las características de la enzima de isoescisión, la enzima de isoescisión, la enzima de homoescisión y la enzima variable, y también considere la sensibilidad de la endonucleasa de restricción seleccionada a la modificación. Además, según la cantidad de enzimas utilizadas en el reactivo, dividimos la reacción de digestión enzimática en digestión enzimática simple, digestión enzimática doble y digestión enzimática paso a paso. Digestión enzimática única: el mismo sistema realiza una reacción de digestión enzimática; Digestión enzimática doble: el mismo sistema realiza dos reacciones de digestión enzimática (enzimas de restricción con las mismas condiciones de reacción) Digestión enzimática escalonada: la muestra se procesa completamente después de la primera reacción de digestión enzimática; , purificar y luego realizar la segunda reacción de digestión enzimática (para enzimas de restricción con diferentes condiciones de reacción). Después de aclarar la información anterior, podemos continuar con la reacción de digestión enzimática. Una reacción de digestión enzimática implica el tipo de muestra, el tampón, la cantidad de enzima, la temperatura y el tiempo de reacción, etc. Estos se pueden realizar consultando las instrucciones del producto para las endonucleasas de restricción.

(2) ADN ligasa

Las enzimas de restricción son las encargadas de cortar el ADN, y la ADN ligasa es una herramienta utilizada para volver a unir el ADN. La ADN ligasa es un tipo de enzima que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre los grupos 5' fosfato y 3' hidroxilo de bases adyacentes en el ADN bicatenario (Figura 6). Debido a que es bicatenario, generalmente se requiere que no haya discrepancias de bases en el sitio de conexión. Sin embargo, en aplicaciones prácticas, la ADN ligasa también ligará el ADN con una pequeña cantidad de desajustes. Hay dos tipos principales de ADN ligasa: ADN ligasa T4 (puede ligar tanto extremos romos como adhesivos) y ADN ligasa de E. coli (solo puede ligar extremos adhesivos).

(3) ADN polimerasa

Anteriormente introdujimos la reacción en cadena de la polimerasa PCR, que utiliza ADN polimerasa. De hecho, la ADN polimerasa tiene tres actividades enzimáticas (Figura 7): actividad de ADN polimerasa para la síntesis de nuevas cadenas de ADN, actividad exonucleasa 3'-5' para la corrección de bases incorporadas por errores y actividad exonucleasa 5'-3', utilizada para eliminar el ARN. cebadores durante la replicación del ADN. Con esta actividad se puede realizar la traducción de Nick, utilizarla para marcar la inserción de nucleótidos, etc. Pero no todas las ADN polimerasas tienen estas tres actividades enzimáticas. El sitio web oficial de la NEB proporciona una serie de ADN polimerasas y sus actividades funcionales (DNA Polymerase Selection Chart-NEB).

Dependiendo del tipo de ADN polimerasa utilizada, los extremos de los productos de PCR incluyen extremos adhesivos 3’-A y extremos romos. Entre ellos, la ADN polimerasa Taq carece de actividad exonucleasa 3'-5', por lo que su fidelidad de PCR es baja, y el extremo 3' del producto de PCR tiene un extremo A extra pegajoso, mientras que la ADN polimerasa de alta fidelidad conserva 3'-5'; actividad exonucleasa y tiene una actividad correctora muy alta y sus productos de PCR tienen extremos romos.

(4) Tecnología de clonación perfecta

Además de las herramientas relacionadas utilizadas en la clonación genética tradicional en China presentadas anteriormente, los investigadores han desarrollado nuevos tipos de tecnología de clonación basada en fragmentos insertados y linealizados. vectores La tecnología de clonación de genes que realiza una recombinación homóloga al final, es decir, Seamless Cloning, incluye principalmente Gibson Assembly [4] y Getway Clone. Aquí nos centramos en el ensamblaje Gibson.

La tecnología Gibson Assembly incluye actividades ADN 5' Exonucleasa, ADN Polimerasa y ADN Ligasa. El método de recombinación de fuentes puede insertar uno o más fragmentos de ADN en un vector linealizado en una dirección predeterminada de forma rápida, eficiente y precisa, y. el clon final construido no tiene secuencias de bases adicionales, por lo que se denomina "clonación perfecta". Como se muestra en el ensamblaje de Gibson en la Figura 9, los fragmentos rojos y verdes son fragmentos de ADN de doble cadena que deben conectarse. Tienen las mismas 15-25 secuencias superpuestas (negras) en sus extremos. Primero, a 50 °C, T5. se elimina el ácido nucleico de exonucleasa. Dicer degrada algunas bases en el extremo 5' para formar una hebra única que sobresale en el extremo 3', y la hebra simple del extremo 3' es complementaria y hibrida, luego la polimerasa de alta fidelidad Phusion llena el espacio entre las dos; dos hebras simples; finalmente, ADN ligasa Taq. Las mellas monocatenarias adyacentes están conectadas para formar un ADN bicatenario completo (Figura 6).

Basado en Gibson Assembly, los investigadores desarrollaron TEDA[5], que también puede lograr la clonación recombinante agregando solo exonucleasa T5. Utiliza el mecanismo de reparación del ADN en la célula para reparar el ADN defectuoso (Figura 6). .

(5) Vectores de herramientas

A continuación, presentamos los vectores de herramientas comúnmente utilizados en la clonación de genes. Según su función, los vectores se dividen en vectores de clonación y vectores de expresión (Tabla 2). El vector de clonación contiene elementos que pueden replicarse en células procarióticas y se utiliza para clonar y amplificar genes; el vector de expresión no solo tiene los elementos básicos del vector de clonación, sino que también tiene elementos cis de ADN necesarios para la transcripción/traducción. A continuación, describiremos los elementos funcionales relevantes utilizando el diagrama de estructura vectorial analizado por SnapGene o addgene.

Tome pUC19 como ejemplo para ilustrar los elementos funcionales en el vector de clonación (Figura 10).

Origen de replicación (ORI): ORI es una secuencia de ADN, la posición inicial de la replicación del plásmido. La ADN helicasa puede actuar sobre esta secuencia, luego las dobles hebras de ADN se separan y comienza la replicación. El plásmido debe ser replicable; de ​​lo contrario, la cantidad de plásmido se diluirá rápidamente a medida que crezcan las bacterias. Los marcadores de detección se refieren principalmente a genes de resistencia a los antibióticos. Cuando se cultivan bacterias en un medio que contiene antibióticos, las que pueden crecer contienen el plásmido objetivo, porque las bacterias sin el plásmido han sido "matadas". Los genes de detección de resistencia comúnmente utilizados en procariotas incluyen Amp y Kan. Lac Z: gen de la β-galactosidasa, también un marcador de detección, utilizado para la detección de manchas azules y blancas. El sitio de clonación múltiple (MCS) es un fragmento corto de ADN que incluye un sitio único para múltiples enzimas de restricción para facilitar la inserción de genes extraños. En términos generales, cuanto más largo es el fragmento de ADN exógeno, más difícil es insertarlo, más inestable es y menor es la eficiencia de transformación.

Tome pcDNA3.1 como ejemplo para ilustrar los elementos funcionales en el vector de expresión (Figura 11).

Además de los elementos relacionados con el vector de clonación, como el sitio de origen de replicación Ori y el marcador de selección procariota Amp, el vector de expresión pcDNA3.1 también tiene algunos otros elementos funcionales, como se muestra en la Tabla 3.

Los vectores de expresión se utilizan principalmente para expresar proteínas o ARN. Por ejemplo, PX458, un vector de expresión comúnmente utilizado en la edición de genes (Figura 12), puede expresar proteína Cas9 y sgRNA al mismo tiempo. Por lo tanto, también llevará algunos otros componentes funcionales (Tabla 4).

El pcDNA3.1 y PX458 presentados anteriormente son vectores de expresión transitorios y no se pueden replicar en células humanas a medida que las células se dividen, el plásmido en una sola célula se diluye continuamente, por lo que solo estos vectores pueden lograr el efecto. de expresión instantánea. Los vectores de expresión lentivirales pueden mediar en la integración de elementos de expresión en el genoma de células humanas. Estos elementos de expresión pueden replicarse junto con la replicación del ADN genómico, por lo que se puede lograr una expresión estable.

Nuestros vectores lentivirales comúnmente utilizados son vectores de terapia génica desarrollados en base al VIH-1 (Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo I). Los vectores lentivirales que portan genes extraños están contenidos en plásmidos empaquetadores lentivirales. Con la ayuda de líneas celulares, los El virus se empaqueta en partículas virales infecciosas, que se pueden recolectar y concentrar para infectar directamente células huésped o modelos animales, y los genes extraños se pueden integrar efectivamente en los cromosomas del huésped, logrando así el objetivo de la expresión exógena persistente de genes. Tomamos pGreenPuro como ejemplo para ilustrar algunos elementos funcionales clave en el vector de expresión lentiviral (Figura 13, Tabla 5).

(6) Células competentes

Las células competentes son células inducidas por métodos físicos y químicos que pueden absorber moléculas de ADN del entorno circundante. En el laboratorio, a menudo utilizamos E. coli para preparar células competentes, incluidas principalmente células competentes para la clonación y células competentes para la expresión (Figura 14).

Si sólo realizamos amplificación de plásmidos, generalmente utilizamos células competentes para la clonación. Si queremos expresar proteínas procarióticas, elegimos células competentes en expresión. También hay muchos tipos de genotipos de células competentes, que se forman mediante la deleción de diferentes genes, dando así a las células diferentes características para satisfacer diferentes necesidades. Por ejemplo, para la amplificación de vectores de clonación y vectores de expresión transitoria, a menudo se usa la cepa TOP10 de E. coli DH5α, mientras que para los vectores lentivirales, generalmente se selecciona la cepa Stbl3 de E. coli con una tasa de recombinación baja; Para la amplificación de vectores no metilados, es necesario seleccionar cepas que carezcan de metilasas como E. coli dam-/dcm-?.

2.? Proceso de clonación de genes

Anteriormente hemos aprendido sobre las enzimas y vectores herramientas relevantes utilizados en la clonación de genes. A continuación, presentamos el proceso experimental de clonación de genes. Desglosado, incluye los siguientes 10 pasos (Tabla 6).

A continuación tomamos la clonación y expresión del lncRNA PVT1 como ejemplos, utilizando la clonación T/A, la clonación tradicional ligada a enzimas y la clonación sin fisuras, respectivamente.

(1)?Clonación T/A

La clonación T/A es un método para ligar el fragmento de PCR con un ADN vector con un saliente 3'-T (Figura 15). Cuando se utiliza este método para la clonación de genes, no es necesario considerar la cuestión del sitio de restricción, pero es necesario seleccionar la ADN polimerasa Taq para la amplificación por PCR, de modo que el extremo 3' del producto tenga además una A sobresaliente; La clonación T/A utiliza comerciales El vector T es un vector linealizado con una T que sobresale en el extremo 3' y no hay direccionalidad cuando el fragmento del gen está conectado al vector T, y es posible tanto en dirección directa como inversa.

Primero obtuvimos la información de la secuencia genética de PVT1 (humano) del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MG562504.1) y luego utilizamos SnapGene y otros para realizar el diseño de cebadores de PCR (Figura 16). Usando la secuencia de longitud completa de PVT1 (1081nt) como plantilla, el extremo 5' del cebador directo del cebador diseñado es el mismo que el extremo 5' de la secuencia PVT1, y el extremo 5' del cebador inverso es complementario. hasta el extremo 3' de la secuencia PVT1. Luego use la ADN polimerasa Taq para realizar la PCR usando el ADNc de la célula como plantilla, y el producto se somete a electroforesis en gel de agarosa o corte de gel para recuperar el fragmento de tamaño objetivo (Figura 17).

El fragmento génico recuperado del gel se ligó con el vector T comercial (pMD-18T) para formar el vector de ADN recombinante pMD18-PVT1 (Figura 18), que se transformó (Figura 19) y se realizó una PCR de colonias. (Figura 20) Después de seleccionar clones positivos candidatos, se utilizó la secuenciación de Sanger (Figura 21) para identificar la secuencia insertada y obtener clones positivos.

(2) Clonación tradicional ligada a enzimas de digestión con enzimas de restricción

La clonación tradicional ligada a enzimas de digestión con enzimas de restricción utiliza principalmente la misma endonucleasa de restricción (o isoenzima) para digerir por separado el vector. y el fragmento de gen se ligan entonces utilizando ADN ligasa y se transforman. A continuación, también tomamos PVT1 como ejemplo y lo clonamos en el vector de expresión pcDNA3.1 utilizando métodos tradicionales.

Después de obtener la secuencia completa del gen PVT1, primero debemos realizar un análisis del sitio de la endonucleasa de restricción, como usar SnapGene para realizar un análisis del sitio de la endonucleasa de restricción del sitio de reconocimiento de 6 bases comúnmente utilizado ( Figura 22). Al mismo tiempo, analizamos los sitios de endonucleasas de restricción disponibles en MCS en pcDNA3.1. Excluimos las endonucleasas de restricción de PVT1 y excluimos las homologasas (para evitar la autoligación del vector), y luego podemos obtener las endonucleasas de restricción disponibles. . Aquí elegimos Nhe I y Eco R I (Fig. 23).

A continuación, utilizamos la secuencia completa de PVT1 como plantilla para diseñar cebadores de clonación (las secuencias de cebadores diseñadas por SnapGene son las mismas que las de la clonación T/A), pero también necesitamos agregar una selección en el extremo 5' de los cebadores. Los sitios de escisión de las endonucleasas de restricción y las bases protectoras correspondientes (Figura 24). La ADN polimerasa Taq u otras ADN polimerasas de alta fidelidad también se utilizan para realizar la PCR utilizando ADNc celular como plantilla. Los productos se someten a electroforesis en gel de agarosa o corte de gel para recuperar fragmentos del tamaño objetivo.

El producto de PCR de PVT1 recuperado y el vector pcDNA3.1 se digirieron dos veces usando Nhe I y Eco R I. La secuencia de PVT1 después de la digestión es un fragmento de aproximadamente 1000 pb y un fragmento de aproximadamente 5 pb. No es necesario realizar corte y recuperación del gel, y puede utilizar directamente la columna de purificación del producto de PCR para purificar el producto de digestión enzimática (Figura 25). Debido a la posible presencia de plásmidos cortados de forma incompleta (se formará una gran cantidad de clones falsos positivos durante transformaciones posteriores), la digestión con enzimas de restricción de pcDNA3.1 requiere electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos del vector linealizado se cortan para la recuperación del gel ( Figura 25). Luego, los fragmentos digeridos de PVT1 y pcDNA3.1 se ligaron usando ADN ligasa y se transformaron. De manera similar, se usaron PCR de colonias y secuenciación de Sanger para detectar el clon positivo pcDNA3.1-PVT1 (Figura 26).

(3) Clonación perfecta

Una ventaja importante de la clonación perfecta es que no es necesario considerar los sitios de corte de enzimas en el fragmento que se va a clonar, por lo que los sitios de corte de enzimas correspondientes Después de linealizar el vector, se diseñan cebadores homólogos basados ​​en los extremos linealizados del vector y el gen objetivo se amplifica por PCR y se purifica para su recombinación, ligación y transformación directa (Figura 27). A continuación, también tomamos la clonación de PVT1 en el vector pcDNA3.1 como ejemplo para ilustrar.

Después de obtener las secuencias completas de PVT1 y pcDNA3.1, puede utilizar software local o en línea como SnapGene, CE Design (Vazyme) e In-Fusion Clone (Takara) para diseñar cebadores de brazos de homología. .

Utilice cebadores de brazos homólogos, ADNc celular como plantilla y ADN polimerasa de alta fidelidad como plantilla para realizar la PCR y recuperar en gel los fragmentos correspondientes. Después de una doble digestión del vector pcDNA3.1 con Nhe I y EcoR I, los fragmentos del vector se recuperaron cortando el gel. Luego agregue reactivo de clonación transparente para recombinación y ligación, y seleccione e identifique clones positivos después de la transformación.

De hecho, la clonación perfecta tiene otra ventaja importante: puede realizar la clonación recombinante de múltiples fragmentos al mismo tiempo, lo cual es un gran desafío para la clonación tradicional ligada a enzimas por digestión enzimática. Según la tecnología de clonación tradicional, puede ser necesario clonar un fragmento, luego seleccionar un sitio de corte de enzima en una posición específica, insertar el segundo fragmento y avanzar en la secuencia. Esto no solo lleva mucho tiempo experimentar, sino que también introduce más. El corte enzimático entre cada fragmento de la secuencia de bases del sitio puede afectar la integridad del gen. Sin embargo, la PCR de fusión se puede utilizar para diseñar cebadores con extremos superpuestos para fusionar cada fragmento clonado. Sin embargo, la amplificación por PCR de fragmentos de genes largos también tiene el problema de aumentar la tasa de fracaso (Tabla 8).

Resumen

En esta sección, presentamos principalmente las enzimas herramienta y los vectores utilizados en la clonación de genes, y tomamos la clonación de PVT1 y la construcción de vectores de expresión como ejemplos para presentar T/ A respectivamente. Procedimientos experimentales para clonación, digestión enzimática tradicional, clonación ligada a enzimas y tecnología de clonación integrada.

Referencias

1. ?Vasu,K. y V. Nagaraja, Diversas funciones de?Sistemas de modificación de restricción además de la defensa celular.MicrobiolMol Biol Rev, 2013. 77 (1). ): págs. 53-72.

2. Loenen, W.A., et al., Aspectos destacados de los cortadores de ADN: ¿una breve historia de las enzimas de restricción? : págs. 3-19.

3. ?Pingoud, A., G.G. Wilson y W.Wende, ¿Endonucleasas de restricción: una perspectiva histórica y más? (12): pág. 7489-527.

4. ?Gibson, D.G., et al., Ensamblaje enzimático de moléculas de ADN hasta? varios cientos de kilobases.Nat Methods, 2009. 6 (5): p.343-5.

5. ? Xia, Y., et al., El ensamblaje dependiente de exonucleasa T5 ofrece un método de bajo costo para la clonación eficiente y la mutagénesis dirigida al sitio. 47 (3): p.e15.