Precauciones para el experimento de invasión de células Transwell in vitro

2. 1

Quimiocinas preparadas a partir de células NIH3T3 y suero de ternera fetal. Las quimiocinas son un tipo de citocina que puede hacer que las células produzcan movimiento quimiotáctico [2]. Actualmente, muchos laboratorios utilizan células NIH3T3 para preparar quimiocinas para experimentos de invasión celular in vitro, lo que lleva mucho tiempo y los pasos experimentales son engorrosos. Como todos sabemos, hay quimiocinas en el suero bovino fetal. Descubrimos en los experimentos de capacidad de invasión in vitro de células cancerosas de vesícula biliar HCCC29810 estimuladas por diferentes concentraciones de TNFα que las quimiocinas preparadas a partir de suero bovino fetal y células NIH3T3 se utilizaron para experimentos de invasión celular. in vitro El efecto es el mismo y el número de células migradas en los dos grupos es muy cercano. En términos de tiempo experimental, el ciclo de uso de células NIH3 T3 para preparar quimiocinas para experimentos de invasión celular in vitro es de 1 semana, mientras que el ciclo de uso de suero bovino fetal como quimiocinas para experimentos de invasión celular in vitro es de 2 días, lo que ahorra mucho. del tiempo experimental. Por tanto, se considera que el suero fetal bovino puede utilizarse para sustituir las quimiocinas producidas por las células NIH3T3.

2. 2 Preparación celular: Las células requeridas deben estar en la fase de crecimiento logarítmico y la viabilidad celular debe ser superior a 95. Si la viabilidad celular es baja, la capacidad de penetración celular se reducirá y los resultados experimentales se verán afectados.

2. 3 Limpie las células en la superficie superior del gel Matrigel y la membrana de policarbonato. Primero use un hisopo de algodón seco para absorber el líquido en la cámara superior y luego limpie suavemente el gel Matrigel con un paño. hisopo de algodón empapado en agua destilada y células en la superficie superior de la membrana de policarbonato. Si las células en la superficie superior de la membrana de policarbonato no se limpian, las células que no se hayan limpiado se incluirán en el recuento de células. Especialmente cuando las células son redondas, no podrá saber si son células que han pasado o no. En el caso de las células fusiformes largas, las células que han pasado tienen forma de huso largo y las células. Los que no han traspasado tienen en su mayoría forma de huso.

2.4 Tinción con hematoxilina: el tiempo para sumergir la cámara superior en hematoxilina nueva es de 1 min, y el tiempo para la hematoxilina que se ha utilizado muchas veces es de 2 min. Al estudiar el efecto inhibidor de la tetrandrina sobre la capacidad de migración de las células endoteliales de la vena umbilical humana HUVEC, el exceso de hematoxilina no se eliminó, sino que se deshidrató directamente y se volvió transparente, lo que resultó en un fondo borroso de las imágenes celulares y células poco claras. Al realizar experimentos sobre la capacidad de invasión in vitro de las células cancerosas de vesícula biliar HCCC29810 estimuladas por diferentes concentraciones de TNFα, las colocamos en un vaso de precipitados lleno de agua del grifo y las enjuagamos varias veces para eliminar el exceso de hematoxilina antes de deshidratarlas y hacerlas transparentes. la imagen de la celda resultante es limpia y las celdas son claras.

2. 5 Tiempo de deshidratación y transparencia El tiempo de deshidratación es de 1 minuto cada uno. El tiempo en xileno no debe ser demasiado largo, de 2 a 3 minutos es apropiado, especialmente cuando se operan varias muestras al mismo tiempo. el tiempo Si es demasiado largo, parte de la película de policarbonato se caerá automáticamente de la base de la cámara superior y las cámaras superiores se pegarán, provocando confusión en la muestra y fallas experimentales. Se recomienda que dos personas trabajen juntas en el último paso del experimento. Una persona identifica y retira la muestra, y la otra corta con cuidado la película de policarbonato de la base de la cámara superior, la coloca sobre un portaobjetos de vidrio y la sella. resina neutra, y la numera en el tiempo.

2. 6 Conteo de Células Cuando las células utilizadas en el experimento son redondas, es fácil para el experimentador confundir los pequeños agujeros en la membrana de policarbonato con células para contar. Cuando estudiábamos el efecto del VEGF sobre la capacidad de invasión de las células HT229 de cáncer de colon humano in vitro, descubrimos que las células HT229 son tan pequeñas que es fácil confundir los pequeños agujeros de la membrana de policarbonato con células para contar.