Para realizar una prueba qPCR, necesita saber lo siguiente
La biología se divide en dos eras: la era pre-PCR y la era post-PCR. En 1983, Kary B. Mullis propuso la idea de la tecnología PCR y, en 1985, publicaron un artículo relacionado en la revista Science. El artículo fue dirigido por el colega de Mullis, Randall K. Saiki. En 1988, Saiki et al. aislaron y purificaron la ADN polimerasa Taq y la aplicaron a las reacciones de PCR, haciendo que la PCR fuera más simple, más fácil y más estable. Desde entonces, la tecnología de la PCR ha marcado el comienzo de un período de vigoroso desarrollo. La PCR ha pasado aproximadamente por las siguientes tres etapas según la precisión de su análisis: (I) PCR de punto final: análisis cualitativo (II) PCR cuantitativa: cuantificación relativa (III) PCR digital: cuantificación absoluta
PCR temprana Se utiliza principalmente para análisis cualitativo y detecta la presencia o ausencia de la secuencia objetivo en función de la presencia o ausencia del producto de punto final de la reacción. Este tipo de PCR se puede llamar PCR de punto final y se usa ampliamente en campos como. identificación de genes y detección de ácidos nucleicos patógenos.
En 1990, Simmonds et al. realizaron una identificación aproximada del número de copias de patógenos como el VHC y el VIH mediante diluciones en gradiente de productos de punto final. Este puede ser el primer estudio de PCR cuantitativo. Sin embargo, cabe señalar que aquí la PCR cuantitativa todavía no se refiere a la PCR cuantitativa de fluorescencia. En ese momento, no se utilizaban sustancias fluorescentes para monitorear los productos de PCR. Hasta 1992, R Higuchi et al. de Roche publicaron un artículo en la revista Nature en el que presentaban un método de seguimiento dinámico de productos de PCR utilizando bromuro de etidio (EB), que puede ser la primera tecnología de PCR cuantitativa fluorescente. En 1996, ABi Company publicó la tecnología qPCR basada en sondas Taqman. En 1997, Wittwer et al. compararon (i) la tecnología qPCR basada en tintes específicos de doble hebra y (ii) la tecnología qPCR basada en tintes específicos de doble hebra. ) Características de qPCR basada en el colorante específico de doble cadena SYBR Green I (ii) Sonda marcada dual basada en nucleasa 5' (iii) Baliza molecular basada en Cy5. Estos estudios sentaron las bases para la posterior aplicación generalizada de qPCR.
En términos generales, qPCR se puede dividir en cuantificación relativa y cuantificación absoluta, pero en esencia, qPCR solo se puede utilizar para cuantificación relativa, y la cuantificación absoluta a menudo requiere la ayuda de "fuerza externa". La amplificación por PCR es una amplificación exponencial. Idealmente, la concentración del producto tiene la siguiente relación con la concentración inicial: N T = N 0 × 2 n (N 0 representa la concentración inicial, N T representa la concentración final y n representa el número de ciclos). , Tomando el logaritmo de ambos lados de la fórmula se obtiene la fórmula: log N T = logN 0 n × log2 (log representa la constante natural e en la base del logaritmo si fijamos la señal de juicio del punto final de PCR en un unificado). valor, entonces se puede lograr una cuantificación absoluta. Si la señal de juicio se fija en un valor unificado (es decir, umbral de fluorescencia), entonces el número de ciclos tiene una relación lineal con el logaritmo de la concentración inicial. Este es el principio básico de la cuantificación relativa de qPCR. Sin embargo, hay dos factores: (1) el ojo humano no puede juzgar con precisión la señal final de la PCR, por lo que apareció un instrumento de PCR de fluorescencia especial (2) diferentes genes objetivo tienen diferentes eficiencias de amplificación y, por lo tanto, no se pueden comparar directamente con el método Ct. nació.
La verdadera PCR cuantitativa absoluta se llama PCR digital (dPCR, el concepto de PCR digital fue propuesto por primera vez por Kinzler et al. en 1999, es un método basado en la PCR de punto final y mediante dilución limitante). Distribución de Poisson. Un método cuantitativo absoluto para calcular el número de copias.
En el estudio de Simmonds et al., diluyeron las moléculas de ADN en una sola copia y luego calcularon el número de moléculas del gen diana basándose en la señal final de la PCR y la ley de distribución de Poisson. Sin embargo, no lo hicieron. Desarrollar aún más esta tecnología durante mucho tiempo, durante mucho tiempo, esta tecnología se ha aplicado con las características del conteo molecular. Por un lado, la dPCR fue suprimida por qPCR durante mucho tiempo y, por otro lado, también estuvo limitada por los instrumentos de detección. No fue hasta 2006 que se recuperó gradualmente.
En 1993, Zachar et al. introdujeron el principio matemático de la cuantificación relativa de genes diana mediante PCR en la revista "Nucleic Acids Research"; en 2001, Livak KJ et al. y aplicaciones del método Ct.
Por supuesto, estos principios son muy simples y fáciles de entender incluso sin leer el artículo. Debido a la amplificación exponencial de la PCR, cuando determinamos los criterios para el punto final, las muestras con una cantidad de plantilla inicial alta llegan primero y las muestras con una cantidad de plantilla inicial baja consumen más ciclos. La diferencia en cada ciclo representa la diferencia en el. concentración inicial 2 veces la diferencia, es decir, N1/N2 = 2 - (Ct1-Ct2). Cuando se analizan diferentes muestras, Ct puede verse afectado por diferencias en el tamaño de la muestra, por lo que se requiere una corrección para los genes de referencia internos. Los genes de referencia internos también se denominan genes de mantenimiento o genes cuidadores. Generalmente se cree que mantienen una expresión constante en diferentes tejidos temporales y espaciales de los organismos. Entonces, el gen de referencia interno ?Ct de dos muestras representa la diferencia en el tamaño de la muestra. del gen objetivo: el ? Ct es la verdadera diferencia de expresión del gen objetivo, que es el método 2 - ?
Sin embargo, hay varias cuestiones que deben tenerse en cuenta: (1) La PCR no siempre se encuentra en la fase de crecimiento exponencial y debe compararse en la fase de amplificación logarítmica (2) La eficiencia de amplificación predeterminada en la fase logarítmica La fase de crecimiento es 100, lo cual no es riguroso, especialmente para algunas plantillas que son difíciles de amplificar, y su eficiencia puede ser muy diferente de 100 cuando se analiza longitudinalmente la expresión de un gen específico (como la expresión del gen A en diferentes etapas de producción). /diferentes tejidos). Pero sigue siendo la expresión del gen diana (como la expresión del gen A en diferentes etapas de producción/diferentes tejidos). Expresión tisular), el uso de 2 - ? Ct puede no ser muy preciso (3) La eficiencia de amplificación de diferentes genes diana es diferente, por lo que al comparar diferentes genes diana horizontalmente, pueden ocurrir grandes errores.
En vista de esto, deberíamos intentar mantener la longitud, GC y Tm del gen diana lo más cerca posible al diseñar cebadores para asegurar una eficiencia de amplificación similar. PrimerBank y qPrimerDB son, respectivamente, mejores sitios web de recuperación de cebadores de qPCR en el país y en el extranjero, que contienen datos de cebadores de qPCR de una gran cantidad de especies y tienen cierto valor de referencia. Además, Pfaffl et al. (2001), Rao (2013) y otros han realizado algunas correcciones al método 2 - ?Ct. El método utilizado es principalmente para corregir la eficiencia de amplificación mediante dilución en gradiente de la misma plantilla, que tiene ciertas características. significado de referencia.
Existen dos métodos para la cuantificación absoluta de qPCR: (1) obtener un gen de referencia con un número de copias conocido, luego calcular la proporción entre el gen objetivo y el gen de referencia y luego calcular el gen objetivo exacto según el valor conocido, mida el número de muestras. Desde esta perspectiva, la cuantificación absoluta es una cuantificación relativa que utiliza la fuerza externa del "número de copias conocido". Este principio fue descrito en 1990 por Gilliland et al. (2) En el método informado por Simmonds et al., la plantilla de ADN se diluye hasta el límite hasta que solo hay una molécula plantilla presente en el sistema de PCR, momento en el cual se puede obtener el número de copias del gen diana en la muestra mediante multiplicando el factor de dilución. Este método es el prototipo de la tecnología dPCR, pero es muy difícil de aplicar en la práctica. En primer lugar, requiere una gran cantidad de gradientes de dilución. En segundo lugar, a menudo es difícil amplificar con éxito con una sola molécula plantilla de una de 10 ordinarias. -Sistema de 20uL.
La aplicación más utilizada de la cuantificación absoluta es el recuento molecular, como la determinación precisa de moléculas de ARN y la identificación de copias de genes en el genoma del ADN. La hibridación Southern es el método más utilizado para identificar el número de copias de genes exógenos. Sin embargo, con el desarrollo continuo de la tecnología qPCR, los informes de identificación del número de copias basados en el método cuantitativo absoluto de qPCR están aumentando gradualmente. Una gran cantidad de estudios han demostrado que la qPCR. El método y el método de hibridación del Sur no son lo mismo. Song et al. (2002) estimaron el número de copias del transgén en callos y plantas de maíz transgénicos mediante qRT-PCR y redeterminaron el número de copias del transgén "exacto" en callos y plantas de maíz mediante hibridación Southern. El estudio también utilizó la hibridación Southern para volver a medir el número de copias del transgén "exacto" en callos y plantas de maíz. Los resultados de la medición de qRT-PCR mostraron una alta correlación con los resultados "exactos", por lo que creyeron que qRT-PCR puede ser. utilizado como un medio eficaz para evaluar el número de copias del maíz transgénico.
La clave para la identificación del número de copia es obtener un estándar de número de copia conocido. Los plásmidos son fáciles de extraer y purificar, por lo que a menudo se utilizan para construir estándares para la cuantificación absoluta. El plásmido recombinante que porta el gen diana se purifica hasta alcanzar una pureza muy alta y se determina con precisión su concentración de ácido nucleico. El número de copias del estándar se puede calcular según la fórmula: N = 6,02 × 10 23 (copias/mol) × M ADN (gramos) / (longitud del ADN (pb) × 650 (gramos/mol/pb)), donde N representa el número de moléculas, M ADN representa el peso del plásmido. Utilice esto como estándar para dibujar una curva estándar de logN frente a Ct, y luego retroceda el número exacto del gen objetivo en función del valor de Ct del gen objetivo. Al mismo tiempo, también necesitamos seleccionar un gen de referencia con un número de copias conocido del genoma, usar el mismo método para dibujar una curva estándar y contar las moléculas, y luego determinar el número de moléculas entre el gen objetivo y el gen objetivo. gen de referencia en la muestra unificada y luego tráigalo. Ingrese la ecuación anterior para obtener el número de copia real del gen objetivo. En términos generales, los genes con un número de copias bajo y altas tasas de conservación dentro de las especies deben seleccionarse como genes de referencia.
Existen muchas formas de identificación del número de copia y no es necesaria una curva de doble estándar. Si se puede confirmar que la eficiencia de amplificación del gen objetivo y el gen de referencia están cerca de 100, también puede usar 2 - Si puede confirmar que la eficiencia de amplificación del gen objetivo y del gen de referencia están cerca de 100. 100, también puede utilizar el método Ct para medir el número de copias del gen diana. Lin Weizhi et al. (2013) utilizaron este método para obtener resultados de identificación del número de copias consistentes con la hibridación Southern.
Existen muchos métodos de genotipado. Landegren et al. (1998) revisaron diversas técnicas de genotipado, entre las que las más utilizadas son la qPCR y la secuenciación. La secuenciación es la más precisa y puede detectar nuevos genotipos. Es el estándar de oro para la genotipificación o detección de SNP, pero su operación es lenta y engorrosa.
El principio básico del genotipado qPCR es que los cebadores con extremos 3' no coincidentes no pueden amplificar el gen diana normalmente. En 1989, Wu et al. y Newton et al. informaron sucesivamente sobre el método ASPCR y el método para detectar alelos. Este método es fácil de entender suponiendo que se sabe que el sitio SNP es A/T, si es un cebador 3'-A. Se utiliza PPCR. En 1995, Livak et al. informaron un método para detectar SNP utilizando sondas con diferentes etiquetas fluorescentes. En este método, se diseñaron dos sondas con diferentes etiquetas fluorescentes para dos genotipos y se incluyeron controles homocigotos y controles de genotipo. Mediante amplificación por PCR, si la señal de fluorescencia está cerca del punto de referencia A, representa el genotipo A, si está cerca del punto de referencia B, representa el genotipo B, y si está entre A y B, es un genotipo heterocigoto (como se muestra en la figura siguiente).
En 2003, Papp et al informaron de un método de tipificación basado en SNP.
Se informa un método de tipificación de SNP basado en curvas de fusión de alta resolución. Este método también se basa en cebadores no coincidentes del extremo 3'. Para el genotipo A, se diseñan cebadores de longitud normal, y para el genotipo B, se añaden 10-15 pb al 5'. final del cebador Para secuencias de GC altas, después de la amplificación por PCR, la Tm de los productos de diferentes genotipos se puede distinguir rápidamente basándose en la curva de fusión de alta resolución del instrumento qPCR.
Después de 1995, el número de artículos de investigación relacionados con qPCR aumentó exponencialmente, convirtiéndose en una de las áreas más candentes de la biología molecular. En los últimos años, con el auge de la industria del diagnóstico molecular, la qPCR ha desempeñado un papel cada vez más importante en el campo médico. El rápido desarrollo de qPCR también ha producido algunos problemas, como estándares de juicio inconsistentes, falta de estándares unificados para la precisión de la detección y graves falsos positivos en la detección de ARN. En 2009, varias instituciones de investigación científica y unidades médicas colaboraron para publicar las "Directrices qPCRMIQE". Las Directrices MIQE estandarizan la terminología común para qPCR, como Ct debe llamarse Cq, RT-PCR debe escribirse como RT-qPCR, etc., y también estandarizan la sensibilidad, especificidad, precisión, etc. del análisis. Además, las directrices también proporcionan especificaciones detalladas para el procesamiento de muestras, extracción de ácidos nucleicos, transcripción inversa, qPCR e incluso análisis de datos. La guía incluye 9 secciones y 85 parámetros para garantizar la practicidad, precisión, corrección y reproducibilidad de los experimentos de qPCR. Aunque las pautas son un poco antiguas, cumplir con estas especificaciones hará que su investigación sea más reproducible y ayudará a los revisores y editores a evaluar rápidamente su manuscrito.
Nota: El contenido y el cronograma de esta guía se pueden encontrar aquí: PCR petitiva para análisis eficiente de múltiples muestras Res. 1993; .2017
[8] Livak KJ, Schmittgen TD Análisis de datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y 2(-) Delta Delta C(T). )método. Methods.DOI: 10.1006/meth.2001.1262
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[16] Huang MM, Arnheim N, Goodman MF Expansión del emparejamiento incorrecto de bases por la ADN polimerasa Taq: implicaciones para la discriminación de un solo nucleótido en la PCR. doi:10.1093/nar/20.17.4567
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