Cómo comprobar la abundancia de expresión de un gen mediante qPCR
En términos generales, MasterMix es una solución concentrada 2X para qPCR en tiempo real, y solo es necesario agregar plantillas y cebadores. Debido a la alta sensibilidad de la qPCR en tiempo real, se requieren al menos 3 pocillos paralelos para cada muestra para evitar que sea posible el análisis estadístico debido a grandes diferencias de Ct o SD demasiado grandes en análisis de datos posteriores. En términos generales, la concentración final de cebadores en el sistema de reacción es de 100 a 400 mM si el molde es ARN total, suele ser de 10 ng a 500, si es ADNc, suele ser 1 ul o una dilución 10 veces de 1 ul; sobre la abundancia de expresión del gen diana Realice ajustes. Por supuesto, estos son valores empíricos. Durante la operación, es necesario realizar la optimización de acuerdo con la MasterMix, la plantilla y los cebadores utilizados para lograr un sistema de reacción óptimo. Durante el proceso de configuración del sistema de reacción, se deben tener en cuenta los siguientes puntos:
1. No congelar ni descongelar MasterMix repetidamente. Si se usa con frecuencia, lo mejor es disolverlo y almacenarlo a 4 grados. .
2. Se preparan más mezclas para reducir los errores de muestreo. Lo mejor es operar sobre hielo.
3. ¡Cada tubo u orificio debe reemplazarse con una punta de tubo nueva! ¡No utilice la misma punta de pipeta para añadir muestras continuamente!
4. Después de añadir todos los ingredientes, centrifugar para eliminar las burbujas de aire.
5. Al menos 3 pocillos paralelos para cada muestra.
Los colorantes de referencia o calibración comúnmente utilizados (colorante de referencia, colorante pasivo) son ROXTM (ahora marca registrada de ABI!) u otros colorantes, siempre y cuando no afecten el valor de fluorescencia de la PCR detectada. producto. La función del tinte de referencia es estandarizar la agitación no PCR en la reacción cuantitativa de fluorescencia, corregir el error de muestreo o el error entre pocillos y proporcionar una línea de base estable. Ahora muchas empresas han formulado ROXTM en MasterMix o Premixture. Si la curva de reacción es buena o el sistema de reacción se ha optimizado, no es necesario agregar colorante ROXTM para la calibración.
En términos generales, el procedimiento de reacción de qPCR en tiempo real no requiere los tres pasos de desnaturalización, hibridación y extensión como la PCR convencional. Dado que la longitud del producto está entre 80 y 150 pb, solo se requieren desnaturalización y recocido. Para métodos de tinte como SYBR@Green, es mejor agregar un proceso de disolución después del proceso de amplificación por PCR para formar una curva de disolución para determinar la amplificación específica del producto de PCR. En cuanto al programa de disolución, los instrumentos tienen configuraciones predeterminadas o son ligeramente diferentes, pero todos recopilan señales de fluorescencia cuando el producto se disuelve.
3. Configuración del instrumento
Las operaciones de todos los instrumentos son básicamente las mismas. La configuración incluye la configuración de la placa y la configuración del programa. Tomemos ABI StepOne como ejemplo para observar la configuración de la reacción en detalle:
A. El primero es elegir el propósito del experimento: cuantitativo u otro. Lo llamamos "BioTeke" y realizamos experimentos "cuantitativos".
B. Selección de métodos experimentales: El método SYBR Green que elegimos para comparar Ct, el programa Fast, utiliza ADNc como plantilla.
C. Configuración de los genes diana: Hay varios genes diana y nombres de los genes diana.
D. Configuración de muestra: incluyendo cuál es el grupo experimental y cuál es el grupo de control. Así como configuraciones para controles negativos y réplicas biológicas.
E. Configuración del grupo de control y genes de referencia internos: esto es para preparar la cuantificación posterior.
F. Basado en el MasterMix de diferentes empresas. Por ejemplo, BioTeke puede activar la ADN polimerasa a 95°C durante 2 minutos (ABI requiere 10 minutos). La reacción del ciclo es de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 15 segundos. Simplemente use la configuración predeterminada del instrumento para el programa de curva de disolución. O el procedimiento recomendado en el manual del instrumento.
G. Configuración del sistema de reacción:
Los cinco pasos A-G se configuran simplemente y puede guardar, modificar el programa de reacción o iniciar la reacción inmediatamente.
Cabe señalar que el instrumento ABI necesita agregar tinte de referencia ROX, y el valor predeterminado es ROX.
Algunas empresas preparan ROX u otros tintes en MasteMix; otras los separan por separado. La selección de este paso debe basarse en el MasterMix de diferentes empresas. No hay ningún tinte de referencia en MasterMix de BioTeke, así que seleccione "ninguno".
Después de la configuración, puede colocar el tubo de PCR configurado en el instrumento y hacer clic en EJECUTAR.
5. Análisis de datos de qPCR en tiempo real
1. Parámetros comunes de qPCR en tiempo real
Línea de base (línea de base)
Generalmente Señal de fluorescencia de 3-15 ciclos
En la misma reacción, es necesario establecer líneas de base separadas para diferentes genes
Umbral (umbral)
La configuración automática es 3-10 veces la desviación estándar de la señal de fluorescencia durante 15 ciclos
Configuración manual: colóquelo en la fase de amplificación exponencial, lo suficiente para ver claramente que la señal de fluorescencia aumenta significativamente.
Los umbrales se pueden establecer por separado para diferentes genes en la misma reacción, pero se debe utilizar el mismo umbral para la amplificación del mismo gen.
Valor Ct: relación lineal con el logaritmo de la concentración inicial.
A la hora de analizar y cuantificar se utiliza generalmente Ct: 15-35. Demasiado grande o demasiado pequeño dará lugar a imprecisiones cuantitativas.
Rn (reportero normalizado) es la relación entre la intensidad de emisión de fluorescencia del grupo indicador fluorescente y la intensidad de emisión de fluorescencia del tinte de referencia.
△Rn: △Rn es el resultado estandarizado obtenido tras restar la línea base a Rn (△Rn=Rn-baseline).
2. Factores clave que afectan el valor de Ct
Concentración de la plantilla
La concentración de la plantilla es el factor más importante que determina el Ct. Contrólelo dentro de un rango adecuado para que Ct esté entre 15-35.
Influencia de los componentes de la solución de reacción
La emisión de fluorescencia de cualquier molécula se ve afectada por factores ambientales, como el valor del pH y la concentración de sal de la solución.
Eficiencia de la reacción de PCR
La eficiencia de la reacción de PCR también afectará el valor de Ct. La amplificación por dilución en gradiente en serie en condiciones con baja eficiencia de amplificación por PCR puede producir una curva estándar con una pendiente diferente en comparación con condiciones con alta eficiencia de amplificación por PCR. La eficiencia de la PCR depende del experimento, el rendimiento de la mezcla de reacción y la calidad de la muestra. En términos generales, son aceptables eficiencias de reacción entre 90-110%.
3. Cómo evaluar el efecto de la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real
Eficiencia de amplificación por PCR: Para evaluar correctamente la eficiencia de amplificación por PCR, es necesario hacer al menos 3. repeticiones paralelas y dilución en gradiente en serie de al menos 5 veces del orden de magnitud (5logs) de la concentración de la plantilla.
Preguntas frecuentes
1. No aparece ningún valor Ct
Los pasos para detectar señales de fluorescencia son incorrectos: generalmente, el método SG utiliza una extensión de 72 °C para recolectar, y el método Taqman generalmente se usa para recolectar señales al final del recocido o al final de la extensión.
Degradación del cebador o sonda: su integridad puede detectarse mediante electroforesis PAGE.
Cantidad de plantilla insuficiente: Para muestras de concentración desconocida, comience con la concentración más alta de la muestra de dilución en serie.
Degradación de la plantilla: Evite la introducción de impurezas y la congelación y descongelación repetida durante la preparación de la muestra.
2. El valor de Ct aparece demasiado tarde (Ct>38)
Baja eficiencia de amplificación: Las condiciones de reacción no están lo suficientemente optimizadas. Diseñe mejores cebadores o sondas; utilice un método de tres pasos para la reacción; reduzca adecuadamente la temperatura de recocido, aumente la concentración de iones de magnesio, etc.
Degradación de varios componentes de la reacción de PCR o cantidad insuficiente de muestra añadida.
El producto de PCR es demasiado largo: generalmente, se utiliza una longitud de producto de 80-150 pb.
3. La relación lineal de la curva estándar no es buena.
Hay un error en la suma de la muestra: el estándar no muestra gradiente.
Degradación del estándar: Evitar la congelación y descongelación repetida del estándar, o preparar y diluir el estándar nuevamente.
Malos cebadores o sondas: rediseñar mejores cebadores y sondas.
Hay inhibidores en la plantilla o la concentración de la plantilla es demasiado alta
4 El control negativo tiene una señal
El diseño del cebador no está lo suficientemente optimizado. : primer-dímeros y la aparición de estructuras en horquilla.
La concentración del cebador no es buena: reduzca adecuadamente la concentración del cebador y preste atención a la relación de concentración de los cebadores ascendentes y descendentes.
La concentración de iones de magnesio es demasiado alta: reduzca adecuadamente la concentración de iones de magnesio o elija un kit de mezcla más adecuado.
La plantilla está contaminada por el genoma: evitar la introducción de ADN genómico durante el proceso de extracción de ARN, o evitar la amplificación no específica mediante el diseño de cebadores.
5. La curva de fusión tiene más de un pico principal.
El diseño del cebador no está lo suficientemente optimizado: se debe evitar la aparición de dímeros de cebador y estructuras en horquilla.
La concentración del cebador no es buena: reduzca adecuadamente la concentración del cebador y preste atención a la relación de concentración de los cebadores ascendentes y descendentes.
La concentración de iones de magnesio es demasiado alta: reduzca adecuadamente la concentración de iones de magnesio o elija un kit de mezcla más adecuado.
La plantilla está contaminada por el genoma: evitar la introducción de ADN genómico durante el proceso de extracción de ARN, o evitar la amplificación no específica mediante el diseño de cebadores.
6. Baja eficiencia de amplificación
Algunos componentes del reactivo de reacción, especialmente el tinte fluorescente, están degradados.
Las condiciones de reacción no están lo suficientemente optimizadas: la temperatura de recocido se puede reducir adecuadamente o cambiar a un método de amplificación de tres pasos.
Hay inhibidores de la reacción de PCR en el sistema de reacción: generalmente se introducen al agregar la plantilla. La plantilla debe diluirse adecuadamente antes de agregarse al sistema de reacción para reducir el impacto de los inhibidores.
7. El mismo reactivo produce diferentes curvas en diferentes instrumentos.
Criterios de valoración: eficiencia de amplificación, sensibilidad, especificidad
Si la eficiencia de amplificación está entre el 90% y el 110%, se trata de una amplificación específica y los datos se pueden utilizar para el análisis.
8. ¿Anormalidad en la curva de amplificación? ¿Como una curva en “S”?
La configuración del tinte de referencia es incorrecta (cuando MasterMix no agrega tinte de referencia, seleccione NINGUNO)
La concentración de la plantilla es demasiado alta o está degradada
La Degradación del tinte fluorescente
Resumen de los problemas de la PCR cuantitativa fluorescente
1. ¿Cuál es la secuencia de encendido y apagado del instrumento de PCR cuantitativa?
Seguir la secuencia correcta de encendido y apagado ayudará a extender la vida útil del instrumento y reducir la frecuencia de fallas del mismo.
Secuencia de inicio: primero encienda la computadora, luego encienda el host del instrumento de PCR cuantitativa después de que la computadora esté completamente iniciada. Después de que se encienda la luz verde en el panel del host, puede abrir la PCR cuantitativa. software de recopilación y realizar el experimento.
Secuencia de apagado: después de confirmar que el experimento ha finalizado, primero apague el software de recolección de señales, luego apague el host del instrumento de PCR cuantitativa y finalmente apague la computadora.
2. ¿Qué tipos de tubos y tapas de reacción son adecuados para experimentos de PCR cuantitativa? ¿A qué debo prestar atención?
Los experimentos de PCR cuantitativa pueden utilizar los siguientes consumibles: placa de reacción óptica de 96 pocillos con película óptica, tubo de reacción óptico de ocho enlaces de 0,2 ml con película óptica, tubo de reacción óptico de ocho enlaces de 0,2 ml con cubierta óptica plana Construcción de tubo de ocho enlaces. Los métodos de uso específicos y los números de artículo de los consumibles de PCR cuantitativos producidos por ABI se muestran en la siguiente tabla:
3. ¿Por qué es necesario desfragmentar el disco de la computadora con regularidad? ¿Cómo organizarlo?
Cuando se ejecuta una máquina de PCR cuantitativa en tiempo real y se utiliza software para analizar resultados experimentales, la computadora eliminará y creará varios archivos, y el espacio libre en el disco duro de la computadora se dividirá en archivos cada vez más pequeños. piezas. Cuando los archivos se almacenan en fragmentos rotos en el disco duro, los programas tardan más en acceder a los archivos porque deben encontrar los fragmentos del archivo varias veces para acceder a diferentes partes. La utilidad de desfragmentación combina varios fragmentos de un archivo y los almacena en la misma ubicación del disco duro, eliminando así la fragmentación de archivos y optimizando el rendimiento del sistema.
El método de desfragmentación es el siguiente:
· En el escritorio de Windows, seleccione Inicio, Mi PC.
· En la ventana (Mi PC), haga clic derecho en el disco duro y seleccione la propiedad (Propiedades).
· Seleccione la pestaña Herramientas en el cuadro de diálogo (Propiedades) y haga clic en Desfragmentar ahora.
· Haz clic en Desfragmentar.
· Cuando aparezca el cuadro de diálogo Desfragmentación completa, haga clic en (Aceptar).
· En el cuadro de diálogo Propiedades del disco local, haga clic en (Aceptar).
· Repita los pasos anteriores para las unidades restantes en la computadora.
4. ¿Cuándo realizar la actualización del Service Pack de Windows?
No realice esta operación. No actualice el sistema operativo de la computadora que controla la máquina qPCR a menos que un representante de Applied Biosystems le notifique que actualice el sistema operativo. La nueva versión del sistema operativo Microsoft Windows puede entrar en conflicto con el software SDS y provocar que el instrumento no funcione correctamente. Si desea instalar un paquete de servicio (paquete de actualización) para actualizar su sistema operativo, debe consultar las notas de la versión proporcionadas con su software SDS para evitar problemas de compatibilidad.
5. ¿Qué datos se deben respaldar?
Se debe realizar una copia de seguridad de sus datos experimentales con regularidad. Se recomienda que la frecuencia de la copia de seguridad sea una vez por semana y se grabe en un CD. Al mismo tiempo, también debe realizar una copia de seguridad de varios archivos de calibración del espectro de fluorescencia pura, archivos de fondo y datos experimentales de verificación de instalación del instrumento de PCR cuantitativa. El directorio donde se encuentran estos archivos es C:/Appliedbiosystems/SDS Document. La siguiente imagen es una muestra del archivo de calibración.
6. ¿Qué tipo de entorno de laboratorio puede garantizar el funcionamiento normal de los instrumentos y equipos?
Un buen entorno de laboratorio puede ayudar a prolongar la vida útil de los instrumentos y reducir la frecuencia de sus fallos. Se recomienda realizar lo siguiente:
Fuente de alimentación: Se recomienda equiparlo con un SAI o regulador de voltaje adecuado.
Ventilación: La ventilación del instrumento debe estar libre de obstáculos.
Temperatura: Se recomienda que el laboratorio esté equipado con aire acondicionado, debiendo controlarse la temperatura entre 10-30°C.
Humedad: 20-80%; para provincias húmedas, se recomienda que el laboratorio esté equipado con un deshumidificador.
Espacio: fácil de operar y seguro.
7. ¿Cómo determinar si el bloque calefactor de muestra del instrumento de PCR cuantitativa está contaminado? ¿Cómo eliminar la contaminación?
Una forma es ejecutar una placa de reacción de corrección de fondo. Cuando uno o más pocillos de reacción muestran continuamente señales anormalmente altas, indica que el pocillo puede estar contaminado con contaminantes fluorescentes.
Otro método consiste en realizar la corrección del ROI sin colocar nada en el bloque de muestra. Cuando la señal de un determinado pozo es significativamente mayor que la de otros pozos, indica que el pozo está contaminado.
Los pasos para eliminar la contaminación del bloque calefactor de muestra son los siguientes:
Utilice una pipeta para tomar una pequeña cantidad de etanol y colóquela en cada pocillo de reacción contaminado.
Sopla varias veces.
Aspirar el líquido residual en el recipiente para líquido residual.
Repetir los pasos anteriores: etanol tres veces y agua desionizada tres veces.
Confirmar que el líquido restante en el pocillo de reacción se ha evaporado.
8. ¿Qué es la corrección de fondo? ¿Con qué frecuencia se realiza la corrección de fondo?
El programa de corrección de fondo mide la intensidad de fluorescencia del blanco del tubo de reacción y el agua utilizados en el instrumento de PCR cuantitativa. Durante el procedimiento de calibración, el instrumento de PCR cuantitativa lee continuamente la intensidad de fluorescencia de la placa de calibración de fondo en 10 minutos y la temperatura de recolección de la señal es de 60 °C. Posteriormente, el software SDS calcula el valor promedio de las intensidades de fluorescencia recopiladas, extrae los resultados y los guarda en un archivo de calibración. El software llamará automáticamente a este archivo de corrección en análisis futuros para restar la señal de fondo de los datos experimentales.
Debido a que la intensidad de la señal de fluorescencia de fondo cambia con muchos factores externos (como contaminación externa, diferentes fabricantes de placas/tubos de reacción, pureza del agua, etc.), generalmente se recomienda realizar una corrección de fondo con regularidad. , Calibre cada tres a seis meses.
9. ¿Qué es la corrección de fluorescencia pura? ¿Con qué frecuencia se necesita calibrar?
La calibración de fluorescencia pura consiste en medir la longitud de onda y la intensidad de la señal de varios estándares de tintes fluorescentes puros. En términos simples, es permitir que el instrumento "comprenda" varios tintes fluorescentes. El software recopila y almacena información de fluorescencia para varios estándares de tintes fluorescentes puros. Durante cada experimento cuantitativo posterior, el software SDS recopila la señal del espectro original de la muestra, compara este espectro original con los datos del archivo de fluorescencia pura y deduce con precisión las porciones superpuestas de señales de diferentes tintes para determinar el tipo de tinte fluorescente. en la muestra y la intensidad de la señal.
Se recomienda realizar una calibración de fluorescencia pura cada seis meses. Antes de ejecutar la corrección espectral, realice la corrección de fondo y la corrección de ROI.
¿Cómo sellar la placa de 10,96 pocillos?
Cuando se utilizan placas de 96 pocillos para experimentos, se recomienda utilizar películas ópticas en lugar de tapas para sellar los pocillos de reacción.
El método de sellado correcto es: primero presione la película a lo largo de la dirección longitudinal de la placa de 96 pocillos, luego transversalmente y finalmente presione a lo largo del borde de la placa para sellarla.
11. Cuando se utiliza un solo tubo o un tubo de 8 tubos para experimentos, ¿cómo se debe colocar en el bloque calefactor de muestra?
Cuando se utiliza un solo tubo o un tubo de 8 tubos para experimentos, y el número de muestras no es grande, se recomienda colocar las muestras simétricamente en el bloque calentador de muestras (TRAY), preferiblemente verticalmente, y dé prioridad a las primeras 6 o 7 columnas, luego colóquelas gradualmente a ambos lados. La ventaja de esto es que la cubierta caliente no se inclina cuando se presiona hacia abajo y la fuerza y el calentamiento de cada tubo de reacción son relativamente uniformes, lo que mejora la precisión de los datos entre los orificios.
12. cuantificación ¿Cuál es la diferencia con la cuantificación relativa?
El objetivo de la cuantificación absoluta es determinar el número de moléculas del gen diana en la muestra, lo que comúnmente se conoce como número de copias. El propósito de la cuantificación relativa es determinar la proporción relativa del contenido del gen diana en dos o más muestras sin conocer su número de copias en cada muestra.
Por ejemplo, si el proyecto de investigación incluye muestras de control tratadas y no tratadas, la muestra no tratada generalmente puede designarse como punto de referencia, con una concentración del gen objetivo del 100 %, y la muestra tratada se dividirá. Al comparar los resultados cuantitativos de las muestras tratadas con los resultados cuantitativos de las muestras de control, se puede calcular el porcentaje de contenido genético de cada muestra tratada con respecto a la muestra no tratada.
Los experimentos de cuantificación absoluta deben utilizar estándares absolutos con números de copias conocidos y se debe realizar una curva estándar. La cuantificación relativa se puede realizar con o sin una curva estándar.
Existen dos métodos para experimentos cuantitativos relativos: método de curva estándar y método de comparación de valores CT. Si se utiliza el método de la curva estándar, se pueden utilizar estándares absolutos o estándares relativos, y los estándares relativos son más simples y fáciles de operar en el experimento. Los estándares relativos son estándares que solo conocen la proporción de dilución de ADN o ARN en la muestra sin conocer el número de moléculas. El método típico consiste en realizar una serie de diluciones en gradiente de una muestra con un número de pg conocido.
El método de comparación del valor CT utiliza la relación matemática de que el valor CT es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración inicial de ADN para calcular el porcentaje relativo entre diferentes muestras.
Los datos cuantitativos absolutos son fáciles de entender, pero es difícil preparar estándares absolutos y determinar su contenido de ADN. Hay muchos kits estándar comerciales disponibles que pueden resolver esta dificultad.
Los estándares relativamente cuantitativos son fáciles de preparar en el laboratorio, pero el procesamiento de datos es engorroso y resulta difícil interpretar los datos experimentales.
13. ¿Cómo se deben procesar los datos experimentales de expresión génica cuantitativa por PCR?
Por lo general se deben hacer tres niveles de corrección.
Primero, corrección de la señal de referencia. El reactivo debe contener una concentración fija de ROX, de modo que las fluctuaciones de la señal de fluorescencia causadas por diferencias en el volumen total de reacción, la ubicación de los pocillos, el grosor de la pared del tubo de ensayo, la transmitancia de luz de la cubierta del tubo, etc. deducido, para que los datos reflejen verdaderamente el proceso de PCR. La calibración ROX puede mejorar en gran medida la precisión cuantitativa y mejorar la reproducibilidad de los datos entre tubos replicados.
En segundo lugar, corrección del control interno. Las muestras agregadas en el experimento se basan básicamente en el volumen, pero es probable que diferentes muestras del mismo volumen provengan de diferentes números de celdas, por lo que es necesario corregir los resultados experimentales según el contenido de cada celda. El método consiste en cuantificar un gen de control interno (como el gen de ARN 18S) mientras se cuantifica el gen diana (como la IL-2) y luego la IL-2/18S. La corrección del control interno permite comparar entre sí datos experimentales de diferentes muestras.
En tercer lugar, calcule el contenido genético relativo con respecto a la muestra de referencia (Calibrador). Por ejemplo, para estudiar la diferencia en la expresión genética entre tratados y no tratados, 0 horas y 6 horas, normales y enfermos, es necesario calcular tratado/no tratado, 6 horas/0 horas, enfermo/normal.
14. ¿Cómo se deben procesar los datos relativamente cuantitativos del método de la curva estándar?
Supongamos que el objetivo del experimento es estudiar los cambios en la expresión del gen IL-2 en un determinado tejido a las 0, 24 y 48 horas después del tratamiento farmacológico. El control interno utilizado es el gen 18S RNA. .
Los resultados de la medición de IL-2 y 18S RNA son el número de pg de RNA total. El método de procesamiento de datos se muestra en la siguiente tabla:
15. ¿Cómo se procesan los datos?
El valor de CT es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración inicial de ADN:
Si (1) las eficiencias de la reacción de PCR entre diferentes tubos son las mismas (2) las eficiencias de la reacción; de estas PCR están cerca del 100%, el contenido relativo (X01/X02) = 2 -ΔΔCT se puede deducir de la fórmula anterior. Supongamos que el objetivo del experimento es estudiar los cambios en la expresión del gen IL-2 en un determinado tejido a las 0, 24 y 48 horas después del tratamiento farmacológico. El control interno utilizado es el gen 18S RNA. Los resultados de las mediciones de ARN de IL-2 y 18S fueron ambos valores CT, pero el número de pg de ARN total no se midió a través de la curva estándar.
16. ¿Cuántas sondas se pueden agregar a cada tubo de reacción?
El número de sondas que se pueden añadir a cada tubo de reacción depende de varios aspectos como el instrumento, el software, los reactivos y el diseño experimental.
El primero es la composición del hardware del instrumento y las capacidades analíticas del software. Partiendo de la premisa de que las capacidades analíticas del software son suficientes, los instrumentos de PCR cuantitativos de detección de longitud de onda completa, como los tipos de tubo láser-CCD, prácticamente no tienen límite en el número de sondas. Si la señal se recopila a través de filtros de color, la cantidad de sondas depende de la cantidad de filtros de color. Agregar sondas requiere agregar o cambiar filtros de color. Cambiar la estructura de un instrumento suele resultar difícil. Tomando como ejemplo los instrumentos de AB Company, 7900 y 7700 son para detección de longitud de onda completa con láser, 7000 y 7300 son para filtros de color de 4 colores y 7500 son para filtros de color de 5 colores.
La segunda es la posibilidad química. Para combinar diferentes fluoróforos y usarlos en el mismo tubo de reacción, sus longitudes de onda de excitación deben ser relativamente cercanas, pero no demasiado, para garantizar la eficiencia de la excitación de la señal y garantizar que las señales no se superpongan ni interfieran, y se puedan distinguir claramente. Los tipos de grupos fluorescentes que se han descubierto son limitados y el número de combinaciones moleculares que cumplen tales condiciones es aún menor. Las mejores combinaciones actuales sólo pueden alcanzar niveles de 4 a 5 fluoróforos por grupo.
El tercero es el diseño del plan experimental y el tipo de sonda seleccionada. Los experimentos de PCR cuantitativa deben utilizar ROX para calibrar la fluorescencia, que ocupa una fluorescencia; el grupo de extinción (TAMRA) de la sonda TaqMan también ocupa una fluorescencia. Para un instrumento de detección de cuatro colores, solo se pueden marcar dos fluoróforos, para 5-. Instrumentos de detección de color, hay 3 tipos de fluorescencia que se pueden utilizar. Si la sonda se cambia a una sonda TaqMan MGB, dado que su grupo de extinción no es fluorescente, se puede utilizar una fluorescencia más para marcar la sonda que la sonda TaqMan. Si los requisitos experimentales no son altos y no se realiza la corrección ROX (AB no lo recomienda), se puede utilizar una fluorescencia adicional para marcar la sonda.
El cuarto es estudiar los requisitos de la propia aplicación. Si estudias los SNP y las mutaciones genéticas, debido a que la mayoría de los genes humanos son dimórficos y solo tienen dos alelos, dos sondas son suficientes. Si se estudia la expresión génica se suelen realizar comparaciones por pares, como tratado versus no tratado, normal versus anormal, etc., además de un control interno, tres colores son suficientes.
Por último, están los requisitos para el control de costes. El propósito de la cuantificación multiplex es mejorar la precisión de los datos y ahorrar costos de reacción. Cuantos más genes se midan simultáneamente, menor será el costo. Pero para añadir de 4 a 5 sondas, se deben añadir de 8 a 10 cebadores al mismo tiempo. Al diseñar cebadores, se debe considerar minimizar la competencia e inhibición entre estos cebadores y otras interferencias, y equilibrar la eficiencia de la PCR entre cada par de cebadores. Aunque esto se puede hacer, se necesita mucho tiempo, mano de obra y recursos materiales para seleccionar la mejor combinación de cebadores y optimizar las condiciones de reacción. Si la escala del experimento es pequeña, es posible que en general no sea rentable.
En aplicaciones prácticas, no se trata simplemente de añadir más sondas, sino de optimizar los beneficios generales. Lo que es más práctico es una reacción de 2 a 3 complejos. El diseño de cebadores y sondas no es demasiado difícil y la optimización de las condiciones de reacción no es demasiado problemática, al tiempo que reduce los costos.
17. Los experimentos de identificación de alelos (como la tipificación de SNP) son estudios cualitativos. ¿Se puede omitir la corrección de fluorescencia ROX?
No, los experimentos de identificación de alelos también requieren la normalización de la fluorescencia ROX para garantizar la precisión y confiabilidad de los resultados experimentales.
Debido a que los factores accidentales como los errores de operación de adición de reactivos, los errores de transferencia de calor del tubo de centrífuga y los errores de transmisión de luz de la cubierta del tubo de centrífuga son inevitables, inevitablemente conducirán a diferencias en la eficiencia de la excitación de la fluorescencia. Las señales originales deben normalizarse y corregirse antes de poder compararlas entre sí y garantizar la reproducibilidad.
Esta corrección se consigue añadiendo ROX al tampón de reacción para corregir la fluorescencia. La concentración de ROX en el tampón de reacción es fija, por lo que los cambios en su señal sólo están relacionados con el efecto general de los cambios físicos anteriores. Dividir la señal de fluorescencia del reportero por la señal de fluorescencia de ROX elimina las fluctuaciones de datos causadas por todos estos factores físicos.
18. ¿Qué datos son más precisos, el método estándar interno o el método estándar externo?
son igualmente fiables. La ventaja del estándar interno es que las condiciones de reacción del gen diana y el gen constitutivo son más consistentes. La desventaja es que los cebadores y sondas del gen diana y el gen constitutivo competirán e inhibirán entre sí, lo que dará lugar a diferencias. en sus eficiencias de PCR. La ventaja de los estándares externos es que no hay posibilidad de competencia o inhibición entre los cebadores y sondas del gen diana y el gen constitutivo. Sin embargo, la diferencia en las condiciones de reacción entre diferentes tubos es mayor que la del mismo tubo, lo que sí lo hará. también conducen a diferencias en sus eficiencias de PCR. Comparando los dos, la precisión de los datos del método estándar interno y del método estándar externo es la misma.