Cómo diseñar cebadores de PCR

Cómo diseñar cebadores

Los cebadores deben extenderse al menos 3 nucleótidos más allá del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción.

Evitar dímeros y autocomplementariedad: Al diseñar cebadores, es necesario evitar la formación de dímeros o autocomplementariedad entre los dos cebadores, lo que afectará a la eficiencia y especificidad de la PCR. Realice pruebas de especificidad: utilice herramientas de software para realizar pruebas de especificidad para garantizar que los cebadores seleccionados solo amplifiquen la secuencia de ADN objetivo y no otro ADN no específico.

El mejor valor de Tm de la secuencia plantilla correspondiente al cebador es de alrededor de 72°C. El valor de Tm es de alrededor de 72°C para condiciones óptimas de replegamiento, que debe estar al menos entre 55-80°C.

La longitud de los cebadores es generalmente de 15 a 30 pb, y comúnmente se usa de 18 a 27 pb, pero no debe ser mayor que 38, porque demasiado tiempo provocará que su temperatura de extensión sea superior a 74 °C. haciéndolo inadecuado para reacciones de TaqDNA polimerasa. Principios de diseño de cebadores para PCR de investigación científica

1. No deben existir secuencias complementarias entre los propios cebadores y entre los cebadores. El valor de ΔG en el extremo 5' y en la mitad del cebador debe ser relativamente alto, mientras que el valor de ΔG en el extremo 3' debe ser bajo. El extremo 5' del cebador se puede modificar, pero el extremo 3' no se puede modificar. La única hebra del producto amplificado no puede formar una estructura secundaria. 1 Los cebadores deben ser específicos.

2. ③ No debe haber ninguna secuencia complementaria dentro del cebador. ④ No debe haber secuencias complementarias entre los dos cebadores, especialmente superposición complementaria en el extremo 3'.

3. 11 reglas de oro para el diseño de cebadores de PCR Los cebadores se diseñan mejor dentro de la región conservada del ADNc molde. Las regiones conservadas de secuencias de ADN se determinan mediante comparación de secuencias similares entre especies.

4. Longitud del principio de diseño del cebador: 15-30 pb, su longitud efectiva [Ln=2 (G + C) + (A + T)] generalmente no es mayor que 38; de lo contrario, la temperatura de extensión óptima de La PCR excederá la temperatura operativa óptima de la enzima Taq (74 grados), reduciendo así la especificidad del producto.

5. El propósito del diseño de cebadores de PCR es encontrar un par adecuado de fragmentos de nucleótidos que puedan amplificar eficazmente la secuencia de ADN molde. Como se mencionó anteriormente, la calidad de los cebadores está directamente relacionada con la especificidad y el éxito de la PCR.

6. Existen tres principios básicos para el diseño de cebadores: las secuencias de cebadores y plantillas deben ser estrechamente complementarias. Evite la formación de dímeros estables o estructuras en horquilla entre los cebadores. Los recebadores no pueden iniciar la polimerización del ADN en sitios no objetivo de la plantilla (es decir, desajustes). ¿Cómo diseñar cebadores durante la amplificación por PCR?

1. El extremo desnatado del cebador 5 se puede modificar. El extremo desnatado del cebador 3 no se puede modificar. El extremo de tres manos del cebador debe evitar la tercera posición del codón.

2. Hay muchas cosas a las que se debe prestar atención en el diseño de cebadores. En la mayoría de los casos, realizamos la amplificación por PCR cuando conocemos la secuencia plantilla conocida. El diseño tiene como objetivo lograr un equilibrio entre dos objetivos: especificidad de amplificación y eficiencia de amplificación.

3. 11 reglas de oro para el diseño de cebadores de PCR Los cebadores se diseñan mejor dentro de la región conservada del ADNc molde. Las regiones conservadas de secuencias de ADN se determinan mediante comparación de secuencias similares entre especies.

4. Puedes utilizar software como oligo6 o primer5 para diseñar. El uso de este software para seleccionar cebadores depende principalmente de la estabilidad de los cebadores, la posibilidad de formación de dímeros, la temperatura de recocido y otros parámetros. Si su homología de secuencia no es alta y el contenido de GC es aceptable, puede utilizar algunos principios empíricos.

5. Los pasos principales de la tecnología de PCR y los principios generales del diseño de cebadores de PCR se describen a continuación: Los pasos principales de la tecnología de PCR: Desnaturalización del ADN: (90 ℃ -96 ℃): plantilla de ADN bicatenario. se calienta. Bajo su acción, los enlaces de hidrógeno se rompen y se forma ADN monocatenario. Métodos y principios de diseño de cebadores de PCR

1. La función de los cebadores en la PCR es servir como sitio de unión para la ADN polimerasa al comienzo de la replicación del ADN. En condiciones extracelulares, el ADN solo puede comenzar a procesarse a través de cebadores. . Copiar.

2. Los principales pasos de la tecnología PCR: Desnaturalización del ADN: (90 ℃ -96 ℃): bajo la acción del calor, la plantilla de ADN bicatenario rompe los enlaces de hidrógeno para formar ADN monocatenario. Recocido: (60 ℃ -65 ℃): la temperatura del sistema disminuye y el cebador se une a la plantilla de ADN para formar una doble hebra parcial.

3. El principio básico de la tecnología PCR: similar al proceso de replicación natural del ADN, su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo.

4. El principio básico de la tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo.

5.℃, el ADN molde y el cebador son complementarios entre sí según el principio de emparejamiento de bases. Extensión: La temperatura de reacción de la solución se eleva a 72 °C. La ADN polimerasa termoestable utiliza ADN monocatenario como plantilla y, bajo la guía de cebadores, utiliza los cuatro desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) en la mezcla de reacción para extruir la solución. Se copia la dirección 5-3'. ¿Cuáles son los principios básicos del diseño de cebadores de PCR?

1. 11 reglas de oro para el diseño de cebadores de PCR Los cebadores se diseñan mejor dentro de la región conservada del ADNc plantilla. Las regiones conservadas de secuencias de ADN se determinan mediante comparación de secuencias similares entre especies.

2. Sigue los siguientes principios: Longitud del primer: La longitud óptima de los primers es de unas 24 o 25 bases. Sin embargo, si es necesario ajustar el valor de Tm, la longitud del cebador se puede controlar entre 21 y 28 bases. Cuando se amplifican fragmentos de ≥10 kb de largo, los cebadores de entre 25 y 35 bases pueden proporcionar mejores resultados.

3. ③ No debe haber ninguna secuencia complementaria dentro del cebador. ④ No debe haber secuencias complementarias entre los dos cebadores, especialmente superposición complementaria en el extremo 3'.

4. Existen tres principios básicos para el diseño de cebadores: las secuencias de cebadores y plantillas deben ser estrechamente complementarias. Evite la formación de dímeros estables o estructuras en horquilla entre los cebadores. Los recebadores no pueden iniciar la polimerización del ADN en sitios no objetivo de la plantilla (es decir, desajustes). Cómo diseñar cebadores para la clonación directa sin fisuras de productos de PCR

El método de cebador de diseño inverso para la clonación perfecta es el siguiente: linealizar el vector de destino: utilizar digestión enzimática o PCR para obtener el fragmento de destino mediante PCR.

El principio de la clonación perfecta Lo primero que hay que destacar es que existen dos escuelas principales de clonación perfecta: Gibsonassembly y GoldenGateassembly.

La temperatura de hibridación debe ser 5°C menor que la temperatura de fusión. Si el cebador tiene menos bases, la temperatura de hibridación se puede aumentar adecuadamente, lo que puede aumentar la especificidad de la PCR si el cebador tiene más. bases, entonces puede reducir adecuadamente la temperatura de hibridación para asegurar la unión del ADN bicatenario.

Principio: El propósito del diseño de cebadores de PCR es encontrar un par de fragmentos de nucleótidos adecuados para que puedan amplificar eficazmente la secuencia de ADN molde. La calidad de los cebadores está directamente relacionada con la especificidad y el éxito de la PCR. . O no. Principio: Los cebadores deben diseñarse dentro de las regiones conservadas de las series de ácidos nucleicos y ser específicos. El producto no puede formar una estructura secundaria.

Puedes utilizar software como oligo6 o primer5 para diseñar. El uso de este software para seleccionar cebadores depende principalmente de la estabilidad de los cebadores, la posibilidad de formación de dímeros, la temperatura de recocido y otros parámetros. Si su homología de secuencia no es alta y el contenido de GC es aceptable, puede utilizar algunos principios empíricos.

Los cebadores se diseñan mejor dentro de las regiones conservadas del ADNc plantilla. Las regiones conservadas de secuencias de ADN se determinan mediante comparación de secuencias similares entre especies. Busque el mismo gen en diferentes especies en NCBI y alinéelo con un software de análisis de secuencia (como DNAman). La misma secuencia de cada gen es la región conservada del gen.