¿Cómo construir un vector de cebo de dos híbridos de levadura?
El doble híbrido de levadura es un método de investigación de interacción de proteínas de uso común. Utiliza un sistema de expresión de vector específico para realizar experimentos de interacción con la proteína cebo y la proteína presa objetivo con la proteína objetivo, respectivamente. Los siguientes son los pasos generales para construir vectores de cebo de dos híbridos de levadura:
Elija un sistema de dos híbridos de levadura apropiado: los sistemas de dos híbridos de levadura comúnmente utilizados incluyen el sistema Gal4 y el sistema LexA. Elija un sistema que se adapte a sus necesidades experimentales.
Diseño de secuencia del cebo: El cebo es la proteína que te interesa. Puede ser una proteína de longitud completa o una región específica de la misma. Se selecciona un fragmento apropiado, normalmente añadiendo un dominio de activación, como el dominio de unión al ADN Gal4, al extremo N o C de la proteína.
Amplificación de genes cebo: Utilización de métodos como la PCR para amplificar la secuencia de ADN del gen cebo a partir de una plantilla adecuada (como ADN genómico o ADNc).
Dos híbridos de levadura
Clonar el gen cebo en el vector cebo: Insertar el gen cebo amplificado en el vector cebo dos híbridos de levadura. Los vectores comúnmente utilizados incluyen pGBKT7 (sistema Gal4) o pLexA (sistema LexA). Estos vectores suelen contener funciones tales como promotores, marcadores y marcadores seleccionables.
Verifique el vector de cebo construido: utilice métodos como la digestión con endonucleasa de restricción y la secuenciación para verificar si el gen de cebo insertado es correcto y está en la dirección correcta.
Transformación de células de levadura: introducir el vector cebo construido en las células de levadura. Los métodos comúnmente utilizados incluyen productos químicos, electroporación o presión reducida.
Cribado: las células de levadura transformadas se suelen cribar utilizando un medio de selección que contiene marcadores de selección apropiados. En el siguiente experimento sólo se pueden utilizar células de levadura que expresen la proteína del cebo.