Uso y análisis de principios de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es uno de los instrumentos de detección más utilizados en los laboratorios analíticos, y sus aplicaciones están cada vez más extendidas. Durante el uso de este tipo de instrumento, inevitablemente ocurrirán varios problemas que afectarán directamente la precisión de los datos medidos y el funcionamiento normal del instrumento. Si los operadores pueden comprender las causas de las fallas, pueden prevenir y eliminar claramente estas fallas, usar el instrumento correctamente y maximizar el rendimiento del instrumento. Hoy compartiremos con usted varias cuestiones a las que se debe prestar atención cuando se utiliza cromatografía líquida de alta resolución desde los siguientes aspectos.
1. Uso de tubos de ensayo
1. Limpieza de los tubos de ensayo.
La cromatografía líquida de alta resolución es un método de análisis muy sensible si se utilizan tubos de ensayo sucios, la precisión de los resultados de la prueba se verá afectada. Por ejemplo, cuando se utiliza metanol como disolvente para disolver una muestra, se utiliza como tapa un pequeño tubo de ensayo con un tapón de goma. De esta forma, cada vez que se inyecta una muestra, se produce un pico de interferencia con un tiempo de retención fijo. Más tarde se demostró que este pico de interferencia fue causado por el metanol que empapó el tapón de goma. Después de reemplazar los componentes disueltos con tubos de ensayo de vidrio, se eliminaron los picos de interferencia.
2. Disolución de tubos de ensayo de plástico.
En los últimos años, los tubos de ensayo de plástico desechables han aportado una gran comodidad a los experimentadores, pero cuando utilizamos disolventes orgánicos, debemos prestar atención al fenómeno de disolución de los tubos de ensayo al utilizar dichos tubos de ensayo para extraer muestras. Algunos disolventes orgánicos (como el cloroformo, etc.) disuelven la pared del tubo y la disolución de estas sustancias a veces genera señales para el detector, interfiriendo así con la medición de la muestra. En este momento, se pueden utilizar las mismas condiciones experimentales para detectar primero si la sustancia extraída contiene la sustancia extraída. La sustancia extraída producirá señales de interferencia al detector. Si hay una señal de interferencia, solo se puede reemplazar mediante una prueba de vidrio. Tubo resistente a disolventes orgánicos.
3. La adsorción de la muestra analizada a la pared del tubo de ensayo.
También se debe prestar atención a este problema; de lo contrario, también afectará la precisión de los resultados de la prueba. En el monitoreo terapéutico de medicamentos (TDM), algunos medicamentos probados, como la amitriptilina y la prometazina, se absorben fácilmente. pared del tubo de ensayo de vidrio, se deben utilizar tubos de ensayo de polipropileno durante la operación para evitar la adsorción durante la extracción. Para evitar la adsorción durante la extracción, se puede utilizar una solución de 0,5 hexametileno diaminometano como agente de extracción, que puede prevenir eficazmente la adsorción.
2. Funcionamiento de la válvula de inyección
En la actualidad, la válvula de inyección comúnmente utilizada en cromatografía líquida analítica de alta resolución es la válvula de inyección 7725, y su estructura de válvula interna de seis vías. Hace que la operación de inyección sea muy conveniente, pero también puede causar problemas si se usa incorrectamente. Por ejemplo, durante el proceso de prueba de cromatografía líquida de alta resolución, a veces ocurren problemas de picos cromatográficos anormales y mala reproducibilidad. Esto se debe principalmente a métodos operativos inadecuados. Para resolver dichos problemas, es necesario partir de los siguientes aspectos.
1. Control del volumen de inyección.
Cuando se utiliza la válvula de inyección para inyectar, la válvula de inyección es un circuito de inyección cuantitativa (el volumen de la válvula de inyección para los circuitos de inyección de análisis general es de 20 ul. La solución de muestra de la válvula tiene un gradiente de velocidad radial). en la tubería del circuito de inyección (es decir, el caudal de líquido en la dirección axial de la tubería es más rápido que el de la pared de la tubería). Por lo tanto, para llenar el bucle de muestra con solución de muestra para una cuantificación precisa utilizando la válvula de inyección, el volumen de la muestra debe ser mayor que el doble del volumen del bucle de muestra. Si se utiliza una jeringa para controlar el volumen de la muestra inyectada, solo se puede inyectar como máximo la mitad del volumen del bucle de muestra para evitar que parte de la muestra se desborde del tubo de desbordamiento, lo que provocaría errores en el análisis cuantitativo.
2. Limpiar la válvula de inyección.
Si quedan residuos de la inyección anterior en el circuito de inyección, inevitablemente contaminarán la siguiente inyección. Para evitar que ocurra este fenómeno, se deben seguir los siguientes pasos: a. INYECTAR y CARGAR dos ubicaciones. Primero, en la posición CARGAR, use una jeringa para inyectar la fase móvil en la válvula de inyección para limpiarla varias veces, con una cantidad de aproximadamente 40 ul cada vez. Luego mueva la palanca de la placa de la válvula de inyección a INYECTAR. Cuando la placa de la válvula de inyección se mueve a la posición INYECTAR, la fase móvil se limpia varias veces y la cantidad utilizada cada vez sigue siendo 40ul. Finalmente, inyecte la muestra en la válvula de inyección nuevamente;
Seguir los pasos anteriores puede evitar la contaminación causada por la válvula de inyección, eliminando así los picos de interferencia y mejorando la precisión de los resultados del análisis.
3. El tubo de rebose de la válvula de admisión está bloqueado.
A veces, el tubo de rebose de la válvula de inyección se obstruye y la aguja no se puede empujar cuando se inyecta la muestra en la válvula de inyección. Este problema se debe a una tubería de desbordamiento obstruida. La principal causa de obstrucción es que la fase móvil que disuelve la muestra es una solución salina y la sal en el tubo de rebose cristaliza en la salida de la muestra. En este momento, remoje la boca del tubo de desbordamiento con agua destilada en un vaso pequeño para disolver los cristales de sal en el puerto y solucionar el problema. Si puede enjuagar repetidamente con agua destilada después de cada inyección para eliminar toda la sal del tubo de desbordamiento, se puede evitar esta falla.
3. Problemas con la fase móvil (MOBLEPHASE)
El metanol y el acetonitrilo se utilizan habitualmente para preparar fases móviles en cromatografía líquida de alta resolución. Los reactivos comúnmente utilizados para la cromatografía líquida de alta resolución son preferentemente reactivos especiales de alta calidad, tales como reactivos cromatográficamente puros. Si los requisitos no son demasiado estrictos, también puede utilizar reactivos puros de alta calidad o incluso reactivos de calidad analítica. Los detectores ultravioleta se utilizan comúnmente en cromatografía líquida de alto rendimiento. Por lo tanto, desde la perspectiva de reducir el ruido de referencia y mejorar la sensibilidad analítica, se utilizan reactivos cromatográficamente puros con pequeña absorción ultravioleta y bajo contenido de impurezas.
1. Filtración en fase móvil.
La fase móvil preparada debe filtrarse a través de una membrana microporosa de tamaño de poro de 0,5um antes de su uso. Esto se debe a que la solución contiene muchas partículas diminutas que son difíciles de detectar a simple vista. Si no se filtran, bloquearán el puerto de la bomba y el filtro en el cabezal de la columna, bloqueando así el canal normal de la fase móvil, aumentando la calidad. Resistencia de la columna cromatográfica y presión de la columna, la eficiencia de la columna disminuye. En este caso, debe reemplazar la fase móvil filtrada y usar un limpiador ultrasónico para remojar el filtro obstruido en una solución acuosa de ácido nítrico al 20 % durante 20 minutos para eliminar la obstrucción del filtro.
2. Desgasificar la fase móvil.
La fase móvil debe desgasificarse antes de su uso para eliminar la mayor cantidad posible de gas disuelto en la fase móvil. De lo contrario, estos gases reducirán el rendimiento del embalaje de la columna y pueden dañar el detector. interferencia. Existen muchos métodos de desgasificación, como la desgasificación ultrasónica, la desgasificación al vacío y la desgasificación de nitrógeno. La desgasificación al vacío y la desgasificación por flujo de nitrógeno son los métodos de desgasificación más utilizados. Mezclar agua y metanol producirá una gran cantidad de burbujas. Si se usa sin desgasificar, las burbujas ingresarán a la columna cromatográfica y al detector, afectando el funcionamiento normal del análisis.
IV.Uso y mantenimiento de columnas cromatográficas
La columna cromatográfica es la parte más importante del cromatógrafo líquido de alta resolución. Si la sustancia medida se puede separar y medir bien, columna cromatográfica. El rendimiento juega un papel decisivo. Por tanto, se debe prestar especial atención al correcto uso y mantenimiento de las columnas cromatográficas en el trabajo diario para prolongar la vida útil de las columnas cromatográficas.
1. Utilizar precolumnas y bolardos.
La precolumna se instala entre la bomba y el inyector, lo que permite que la fase móvil alcance el equilibrio completo en la columna cromatográfica y evita que entren en la columna componentes o contaminantes que tienen un efecto destructivo en el empaque de la columna. columna cromatográfica. Las precolumnas evitan que entren componentes que están fuertemente adsorbidos en la columna y deben empacarse de la misma manera que la columna. La precolumna y la precolumna se pueden reemplazar con frecuencia sin necesidad de reemplazar la columna con frecuencia, extendiendo así la vida útil de la columna.
2. Evitar que entre gas en la columna cromatográfica.
Algunas columnas cromatográficas (como las columnas de gel) no permiten la entrada de burbujas de aire, de lo contrario se reducirá la eficiencia de la columna cromatográfica e incluso se formarán pequeñas células de aire difíciles de restaurar. Por lo tanto, para evitar que entren burbujas en la columna, debe utilizar fase móvil desgasificada e instalar la columna estrictamente de acuerdo con los siguientes pasos: a. Desenrosque el tornillo de sellado en la entrada de la columna y observe si hay fugas de solvente; Si hay fugas de disolvente Si no hay fugas de disolvente, la columna se puede conectar a la tubería para evitar burbujas. Si no hay fugas de disolvente, significa que ha entrado aire por este extremo de la columna. En este momento, el extremo de salida de la columna cromatográfica se puede conectar a la válvula de inyección y la columna se puede lavar con la fase de flujo en la dirección opuesta para eliminar el aire en la columna.
Es mejor lavar la columna con un caudal pequeño de 0,2 ml/min. Si el caudal de disolvente es demasiado rápido o la presión aumenta repentinamente, el rendimiento de la columna disminuirá si no hay burbujas en el flujo. Disolvente, significa que el gas en la columna se ha agotado, luego conecte la columna cromatográfica en la dirección correcta para evitar que entren burbujas de aire en la columna cromatográfica.
3. Limpiar la columna.
Para evitar que las sustancias e impurezas medidas permanezcan en la columna cromatográfica, la columna cromatográfica debe limpiarse a tiempo después de cada análisis de muestra. En primer lugar, se debe eluir un disolvente con gran capacidad de elución de la muestra a medir en la columna cromatográfica. Tomando como ejemplo la cromatografía de fase inversa comúnmente utilizada en trabajos analíticos, ya que el primer material que fluye es una sustancia polar, 100. En este momento se debe utilizar metanol o isoenol. Los disolventes polares como la acetona y el tetrahidrofurano eluyen las sustancias menos polares adsorbidas en la columna. La cantidad de eluyente es generalmente 20 veces el volumen de la columna cromatográfica. Si la fase móvil es una solución tampón, la columna debe lavarse primero con agua destilada para eliminar las sales de la columna y luego lavarse con un disolvente adecuado.
La columna de gel utilizada en la cromatografía de filtración en gel suele utilizar una solución tampón como fase móvil y, por supuesto, debe enjuagarse con agua destilada después de su uso. Si se trata de una operación continua, la solución tampón se puede dejar en la columna durante la noche, pero es mejor mantener el caudal pequeño (