¿A qué debe prestar atención al realizar una amplificación por PCR?
Además, se debe tener cuidado en el paso de extracción del sobrenadante, y dejar la parte cercana a la precipitación tal cual, de lo contrario habrá contaminación proteica, lo que afectará el ratio.
2. Homogeneizar antes de agregar cloroformo. La suspensión se puede almacenar a -70 °C durante más de un mes y el precipitado de ARN en etanol al 70 % se puede almacenar a 4 °C durante una semana y a -20 °C durante un año. .
Extracción total de ARNm (experiencia personal)
1. Reactivos necesarios para el reactivo Trizol
1. Cloroformo: Cloroformo (grado analítico)
2 Alcohol isopropílico: Alcohol isopropílico (grado analítico)
3. etanol (en DHT)
4. Etanol (agua tratada con DEPC): 75% de etanol. Requiere etanol absoluto de grado analítico diluido con agua libre de ARNasa tratada con DEPC al 0,01 %.
4. Agua libre de RNasa: Agua libre de RNasa.
4. Agua libre de RNasa: Agua libre de RNasa: Añadir 0,01 % (V/V) de DEPC a 500 ml (50 ml) d H2O, 37 °C durante la noche, autoclave (150 °C durante 3 horas)
5. Guantes de plástico desechables
6. Nota: Se sospecha que DEPC causa cáncer
Acerca del proceso de uso del reactivo Trizol:
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1.
1. Homogeneización
a. Tejido: Tejido:
Agregue 1 ml de reactivo Trizol por 100 mg de homogeneizado de tejido y el volumen de la muestra no debe exceder el 10 % del reactivo Trizol.
b. Células de crecimiento monocapa (las lesiones aparecen después de que las células monocapa se exponen al virus)
Método de extracción de ARN total de células JEV:
Las células BHK21 crecen. en una sola Después de la aplicación de capas, agregue 0,5-1 ml de veneno (use una botella grande), adsorba a 37 °C durante 1 hora, viértalo, agregue aproximadamente 5 ml de solución de mantenimiento (que contiene 2 % de suero y MEM que contiene 2 % de suero y HEPE8). ), y manténgalo durante varios días. Cuando se encuentre entre el 75% y el 100% de las células enfermas, enjuague las células dos veces con PBS (preenfriado), luego agregue el reactivo Trizol directamente al matraz de células en una cantidad de 1 ml/10 centímetros cuadrados, pipetee las células varias veces para realizar la lisis de las células (los matraces de células vienen en dos tamaños de uso común: el grande mide aproximadamente 45 centímetros cuadrados y el pequeño mide aproximadamente 30 centímetros cuadrados, por lo que el reactivo Trizol utilizado es de aproximadamente 4,5 ml y 3 ml respectivamente). (La cantidad de reactivo Trizol agregado se basa en la botella de células y cubre el fondo de la botella, no en la cantidad de células, de lo contrario causará contaminación del ADN) El método específico es el siguiente: (Las muestras deben ser frescas)
(1 ) Coloque el tejido en un tubo EP preenfriado, agregue 1 ml/10 cm2 de reactivo Trizol (se debe agregar la cantidad, de lo contrario es fácil de contaminar), mezcle y pipetee varias veces para romper las células. , y luego dejarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que los núcleos se rompan. Los complejos de nucleoproteínas se separan por completo.
(2) Añadir 0,2 ml de cloroformo (0,2 ml de cloroformo por cada 1 ml de reactivo Trizol), tapar, agitar vigorosamente durante 15 s y dejar a temperatura ambiente durante 2-3 min.
(3) Centrifugar a 4°C, 10.000 g x 15 min. Después de la centrifugación, la mezcla se separa en una capa inferior de color rojo claro, una capa intermedia de fase fenol-cloroformo y una capa superior de fase incolora. Fase acuosa. La fase acuosa contiene ARN y su volumen es aproximadamente igual a Añadir el 60% de la cantidad de reactivo Trizol.
(4) Aspirar con cuidado la fase acuosa superior y transferirla a otro tubo EP.
(5) Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico para precipitar el ARN (añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico por 1 ml de reactivo Trizol) y dejarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
(6) Centrifugar a 10.000 g × 10 minutos a 4 °C. El ARN precipitará en una capa de perlas transparentes similares a gel que se adhieren al fondo y a la pared del tubo.
(7) Desechar el sobrenadante, añadir 1 ml de etanol al 75% preenfriado (añadir al menos 1 ml de etanol al 75% por 1 ml de reactivo Trizol), agitar bien, lavar el precipitado, 4 ℃, 5500 Centrifugar a g × 5 minutos. Deseche el sobrenadante, séquelo al aire (o séquelo al vacío), luego resuspenda el sedimento en dH2O libre de ARNasa, pipetee varias veces, luego incube a 55 ℃ -60 ℃ durante 10 minutos para disolver el ARN e incube a -70 ℃ Guardar para uso posterior.
(8) Después de secar el ARN celular total, añadir 50ul de agua, de los cuales se añaden 990ul de agua libre de RNasa a 10ul, diluir 100 veces hasta 1ml, colocar en una cubeta de cuarzo de 0,5cm de espesor. y agregue agua libre de RNasa para el control, pruébelo en el espectrofotómetro UV 721 y el resultado debe ser una relación A260/280 <1,6.
(9) Después de secar el ARN celular total, añadir 10 ul a 990 ul de agua libre de RNasa y diluirlo 100 veces hasta 1 ml. /p>
(9) Utilice 800 ul de reactivo Trizol para separar 10 mg de tejido (tejido puro).
(10) Identificación de productos de amplificación
El método de tratamiento con DEPC es el siguiente:
1. agua: agregue 0,2 ml de DEPC a 100 ml de agua ultrapura, mezcle bien y luego esterilice en autoclave.
(2) Puntas (puntas de tubería), tubos EP y otros equipos que entran en contacto con el ARN al extraer ARN y RT (incluidas puntas de 1 ml, 200 μl, 20 μl; tubos EP y tubos de reacción de PCR, etc. ): Remojar en agua DEPC al 0,1 % (1000 ml de agua ultrapura más 1 ml de DEPC), 37 °C y esterilizar en autoclave durante la noche.
2. Extraer el ARN y disolverlo en agua DEPC
3.RT
Utilizo un instrumento de PCR para controlar la temperatura y el tiempo, por lo que la RT está en el tubo de reacción de PCR completado.
4. Utilice guantes desechables durante la operación y cámbielos con frecuencia.
Lo mejor es utilizar agua DEPC para tratar todo lo que deba estar en contacto directo con la muestra. Después de insertar la punta de la caja de puntas, agregue 1-2 ml de agua DEPC al 0,1% y luego desinfecte. ; ahora hay puntas importadas. Las puntas RNASE FREE se pueden utilizar directamente sin procesar.
Cómo prevenir la contaminación
Una vez que la máquina haya terminado de funcionar, no deseche los productos de PCR al sacarlos, envuélvalos en guantes de plástico u otros nudos y tírelos al recipiente. bote de basura.
(1) Reactivos: Al mezclar, intente empaquetarlos por separado. No utilice la botella original varias veces.
(2) Adición de muestra: el principio es agregar el ADN al final y los demás reactivos se agregan en orden descendente de volumen. Si hay varios tubos de ensayo con el mismo cebador y sonda, pero el ADN es diferente, el método consiste en calcular el volumen total y agregarlo a un tubo de ensayo, mezclarlo bien y luego distribuirlo en cada tubo de ensayo. evitar errores y contaminación.
Además, los laboratorios generales son propensos a la contaminación y el grado de contaminación es muy alto. Es más relevante cuando la electroforesis y la preparación y extracción de plásmidos se realizan en la misma sala. causar contaminación de alta concentración es abrir la tapa y los productos de dilución de plásmido.
Actualmente, la mayoría de los kits de diagnóstico proporcionados por empresas nacionales y extranjeras utilizan UNG para prevenir la contaminación. La uracil-DNA N-glicosilasa (UNG) es una uracil-DNA glicosilasa extraída de un clon recombinante de Escherichia coli.
Cuantificación de ARN
Lo mejor es al menos utilizar la electroforesis para que el ARN, por un lado, se pueda cuantificar y, por otro, se pueda observar su integridad. Comparar diferentes muestras con un espectrofotómetro es aún menos preciso.
Lo más importante para la conservación del ARN es la temperatura -20ºC no es suficiente, preferiblemente -80ºC, y el nitrógeno líquido es el más seguro.
El ARNm no puede sustituir el análisis del nivel de proteínas. también está la eficiencia de la traducción y la influencia de la tasa de degradación del ARN.
Hay dos formas de hacer RT-PCR:
Hay dos métodos:
Si. Las condiciones lo permiten, puedes utilizar un kit para hacerlo.
Si las condiciones son buenas, puede usar un kit para completar la PCR en un solo paso; si las condiciones no son buenas, puede usar un kit para realizar la transcripción inversa primero y luego completar la PCR en dos pasos. , pero se descubre que los resultados del método de dos pasos son más ideales, las bandas son más específicas y no hay fenómeno de cola. Supongo que esto se debe a que un sistema más uniforme es más propicio para la PCR.
Creo que es necesario hacer referencias cada vez.
La electroforesis no se puede realizar juntas, no importa, lo que se calcula es el grado de expresión relativo, la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa son expresión relativa de genes, no expresión absoluta
Aislamiento y purificación de ARNm
Paso (4) Incubar la solución de ARN a 65 °C y enfriar a temperatura ambiente antes de tomar la muestra. Hay dos propósitos: uno es destruir la estructura secundaria del ARN, especialmente la cola Poli (A+) del ARNm, de modo que la cola Poli (A+) quede completamente expuesta y mejore la tasa de recuperación del ARN Poli (A+); El propósito es hacer que el ARNm se una y se disocia del ARNr; de lo contrario, provocará contaminación por ARNr. Por lo que este paso no se puede omitir.
A continuación, presentaremos un método para confirmar si hay RNasa residual en la solución de ARN.
3) Prueba de mantenimiento
El método es muy sencillo Según la concentración de la muestra, se extraen dos porciones de 1000 ng de ARN de la solución de ARN y se añaden a un recipiente de 0,5 ml. tubo de centrífuga y use Tris con pH 7,0. Agregue tampón hasta un volumen total de 10 ul, luego tape bien el tubo de centrífuga.
Una vez transcurrido el tiempo, se extraen dos muestras para realizar electroforesis. Después de la electroforesis, compare las bandas de electroforesis de las dos muestras. Si las bandas de las dos muestras son iguales o no tienen diferencias obvias (por supuesto, sus bandas también deben cumplir las condiciones del Método 2), significa que no hay contaminación residual de ARNasa en la solución de ARN y que la calidad del ARN es buena. . Por el contrario, si hay una degradación significativa en las muestras almacenadas a 70°C, indica contaminación por RNasa en la solución de ARN.
Contaminación por PCR y contramedidas
) Contaminación del producto de amplificación por PCR. Este es el problema de contaminación más importante y común en las reacciones de PCR, así que preste atención a los instrumentos en el área de amplificación, como las puntas de pipeta.
Otra forma que fácilmente se pasa por alto y que es más probable que cause contaminación de los productos de PCR es la contaminación por aerosoles; los aerosoles se forman cuando las superficies del aire y el líquido se frotan y el tubo de reacción se agita violentamente durante la operación, lo que hace que se abra la tapa. , chupando muestras, y cuando la pistola de inyección chupa muestras repetidamente, se formarán aerosoles que contaminarán. Se calcula que una partícula de aerosol puede contener 48.000 ejemplares, por lo que la contaminación que provoca es un problema que merece especial atención.
1 Área de procesamiento de muestras, que incluye la preparación de la plantilla de amplificación;
2 Área de amplificación por PCR, que incluye la preparación de la solución de reacción y la amplificación por PCR;
3 Área de análisis del producto; , análisis de electroforesis en gel, fotografía de productos y preparación de clones recombinantes.
Cada área de trabajo debe estar separada, los equipos deben estar dedicados y colocados en una dirección determinada. Por ejemplo: preparación de muestras → amplificación por PCR → análisis del producto → procesamiento del producto.
Recuerde: No se permite traer productos y equipos del área de análisis de productos a las otras dos áreas de trabajo.
Utilice puntas de pipeta desechables y está estrictamente prohibido mezclarlas con puntas de pipeta en la sala de análisis de productos de PCR. Las puntas de pipeta no deben exponerse al aire durante mucho tiempo para evitar la contaminación por aerosoles;
Manipular varias muestras Al preparar la mezcla de reacción, primero mezcle los dNTP, los tampones, los cebadores y las enzimas y luego haga alícuotas de ellos. Esto puede reducir las operaciones, evitar la contaminación y mejorar la precisión de la reacción.
La mezcla de reacción debe ser consistente con el producto de PCR. La reacción en la cámara de análisis se mezcla, lo que puede reducir las operaciones, evitar la contaminación y mejorar la precisión de la reacción. p>
Contaminación de la solución de reacción
Para tratar la contaminación se puede utilizar uno de los siguientes métodos:
1. Método DNasa I: en la PCR mezcla (excluyendo la plantilla y agregue 0,5 U de ADNasa I a la polimerasa Taq), reaccione a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego inactiva mediante calentamiento, luego agregue la plantilla y la polimerasa Taq para una amplificación por PCR normal.
La ventaja de este método es que no es necesario conocer la secuencia del ADN contaminante;
(3) Método de la uridil glicosidasa (UNG)
Debido a la irradiación ultravioleta, se fragmentan menos se descontaminan más de 500 pb. El efecto no es bueno y el fragmento de amplificación por PCR utilizado en las pruebas clínicas generalmente ronda los 300 pb, por lo que el efecto preventivo de UNG es cada vez más valorado y reconocido.
1. Todos los tubos EP, vidrio y otros utensilios utilizados para extraer ARNm deben remojarse en agua DEPC al 0,1%. Luego secar, esterilizar en autoclave y secar nuevamente.
2. Después de limpiar con agua DEPC, por supuesto no se puede limpiar con agua bidestilada. Entonces, ¿cuál es el punto de tratarlo con DEPC? ¿Aun así necesito usar agua bidestilada para lavarme?
3. Horneado en seco de cristalería: 180 grados, más de 8 horas, también se pueden tratar vasos pequeños con un poco de cloroformo. Además, los productos de hierro, los puertos de investigación, etc. también se pueden quemar directamente vertiendo alcohol en ellos.