Principio del empaquetado de lentivirus
Introducción y aplicación del paquete lentiviral
El vector lentiviral es una terapia génica desarrollada sobre la base del portador del VIH-1 (virus de inmunodeficiencia humana tipo I). Los vectores lentivirales se diferencian de los vectores retrovirales ordinarios en que pueden infectar tanto células en división como células que no se dividen. Los vectores lentivirales se han desarrollado rápidamente y se han estudiado intensamente. Este vector puede integrar eficazmente genes extraños en el cromosoma del huésped para lograr una expresión continua. En términos de capacidad de infección, puede infectar eficazmente células nerviosas, células hepáticas, cardiomiocitos, células tumorales, células endoteliales, células madre y otros tipos de células, logrando así buenos efectos de terapia génica. Se han llevado a cabo investigaciones clínicas en los Estados Unidos y. ha logrado buenos resultados, por lo que tiene amplias perspectivas de aplicación.
El lentivirus también se ha utilizado ampliamente en la investigación de la expresión de ARNi. Dado que la transfección con lipofectamina no funciona bien en ciertos tipos de células, la vida media del ARNip transferido a las células es corta y el efecto inhibidor del ARNip sintetizado in vitro sobre la expresión génica suele ser de corta duración, por lo que su aplicación es muy limitada. La estrategia de construir primero un vector de expresión de ARNip in vitro y luego transferirlo a células para su transcripción no sólo puede aumentar el número de células transfectadas eficazmente por liposomas, sino también inhibir la expresión génica tan eficazmente como el ARNip sintetizado in vitro, e incluso estabilizar la expresión a lo largo del tiempo. a largo plazo. El vector desempeña un papel a largo plazo en el bloqueo de la expresión genética en las células. En el vector de expresión de ARNip construido, la síntesis de ARN está guiada por el promotor de la ARN polimerasa III. Debido a que la ARN polimerasa III tiene secuencias de inicio y parada claras, el ARN sintetizado no tendrá una cola poli A. Cuando la ARN polimerasa III encuentra 4 o 5 T consecutivas, la transcripción que dirige se detiene y se forman de 1 a 4 U en el extremo 3' de la transcripción. Los promotores de ARN U6 y H1 son dos promotores dependientes de la ARN polimerasa III caracterizados por sus propios elementos ubicados aguas arriba de la región transcrita, adecuados para la expresión de bucles madre de ~21ntRNA y ~50ntRNA. En el vector de expresión de siRNA, las hebras positivas y negativas de siRNA pueden ser transcritas por sus respectivos promotores, y luego las dos hebras pueden ser complementarias para formar siRNA; el ARN en forma de horquilla pequeña (shRNA) también puede expresarse directamente mediante el vector, que contiene. ARN polimerasa III. Secuencia de bucle de tallo entre el promotor y el sitio de terminación de la transcripción 4-5 T que se pliega después de la transcripción. El vector contiene una secuencia de tallo-bucle ubicada entre el promotor de la ARN polimerasa III y el sitio de terminación de la transcripción 4-5 T. Después de la transcripción, se puede plegar en una estructura de tallo-bucle con protuberancias 3' de 1-4 U y procesarse adicionalmente. la célula en ARNip. Antes de construir un vector, generalmente es necesario encontrar ARNip eficiente sintetizando ARNip y luego seleccionar una secuencia que cumpla con los requisitos del vector e introducirla en el vector de expresión de ARNip.