¿A qué debe prestar atención al realizar una amplificación por PCR?
Además, se debe tener cuidado en el paso de extracción del sobrenadante, desechando la parte cercana a la precipitación, de lo contrario habrá contaminación proteica, lo que afectará el ratio.
2. Antes de agregar cloroformo El homogeneizado se puede almacenar a -70°C durante más de un mes, y el precipitado de ARN en etanol al 70% se puede almacenar a 4°C durante una semana y a -20°C durante un año.
Extracción de ARNm total (mi propia experiencia)
1. Reactivos necesarios para el reactivo Trizol
1. Cloroformo: Cloroformo (grado analítico)
2. Alcohol isopropílico: Alcohol isopropílico (grado analítico)
3. Etanol al 75 % (en DTPA)
3. Etanol (en agua tratada con DEPC): etanol al 75 % . Requiere etanol absoluto de grado analítico diluido con agua libre de ARNasa tratada con DEPC al 0,01 %.
4. Agua libre de RNasa: Agua libre de RNasa.
4: Añadir 0,01 % (V/V) de DEPC a 500 ml (50 ul) d H2O, incubar a 37 °C durante la noche y esterilizar en autoclave (150 °C durante 3 horas)
5 .Guantes de plástico desechables
6. Nota: Se sospecha que DEPC causa cáncer
2. Acerca del proceso de uso del reactivo Trizol:
1.
1. Homogeneización
a. Tejido:
Utilizar 1ml de reactivo Trizol por cada 100mg de homogeneizado de tejido, y el volumen de muestra no debe exceder el 10% del volumen de muestra. Reactivo trizol.
b.Tejido:
Utilizar 1ml de reactivo Trizol por cada 100mg de homogeneizado de tejido, y el volumen de muestra no debe exceder el 10% del reactivo Trizol.
b.Células que crecen en una monocapa (las células de la monocapa se enferman después de recibir venenos)
Extraer el ARN total de las células JEV:
Cultivo de células BHK21 Después de formar una monocapa de células, reciba 0,5-1 ml de veneno (envasado en un vial), adsorba a 37 °C durante 1 hora, luego viértalo y agregue una solución de mantenimiento (que contiene 2 % de suero y HEPE8 MEM) a la muestra. Agregue aproximadamente 5 ml de solución de mantenimiento (que contenga 2 % de suero y HEPE8 MEM) y manténgala durante varios días. Cuando se encuentre entre el 75% y el 100% de las células enfermas, enjuague las células dos veces con PBS (preenfriado), luego agregue el reactivo Trizol directamente en el frasco de células en una proporción de 1 ml/10 cm2 y sople aire varias veces para lisar. las células (los matraces de células vienen en dos tamaños comúnmente utilizados: el grande mide aproximadamente 45 centímetros cuadrados y el pequeño mide aproximadamente 30 centímetros cuadrados, por lo que la cantidad de reactivo Trizol es aproximadamente 4,5 ml y 3 ml respectivamente). (La cantidad de reactivo Trizol agregado se basa en la botella de células y el grado de cobertura del fondo de la botella, no en la cantidad de células, de lo contrario causará contaminación del ADN) El método específico es el siguiente: (Las muestras deben ser fresco)
(1 ) Poner el tejido en un tubo EP preenfriado, añadir 1ml/10cm2 de reactivo Trizol (la cantidad debe ser suficiente, de lo contrario es fácil de contaminar), mezclar bien, pipetear varios veces para romper las células, luego déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego agregue el reactivo Trizol. Las células se pipetearon varias veces para romperlas y luego se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar completamente los complejos de nucleoproteínas.
(2) Añadir 0,2 ml de cloroformo (0,2 ml de cloroformo por cada 1 ml de reactivo Trizol), tapar, agitar vigorosamente durante 15 s y dejar a temperatura ambiente durante 2-3 min.
(3) Centrifugar a 4°C, 10.000g x 15 minutos. Después de la centrifugación, la mezcla se dividirá en una capa inferior de fase roja clara, una capa intermedia de fase de fenol-cloroformo y una capa superior. de fase acuosa incolora. La fase acuosa contiene ARN y tiene un volumen equivalente a aproximadamente el 60% del reactivo Trizol añadido.
(4) Aspirar con cuidado la fase acuosa superior y transferirla a otro tubo EP.
(5) Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico para precipitar el ARN (añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico por 1 ml de reactivo Trizol) y dejarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
(6) Centrifugar a 4°C, 10.000g×10 minutos. El ARN precipita en el fondo y las paredes del tubo en forma de un gel transparente.
(7) Desechar el sobrenadante, añadir 1 ml de etanol al 75% preenfriado (al menos 1 ml de etanol al 75% por 1 ml de reactivo Trizol), agitar bien, lavar el precipitado, 4° C, 5500 g Centrifugar durante ×5 minutos. Deseche el sobrenadante, séquelo al aire (o al vacío), resuspenda el sedimento en dH2O libre de RNasa, sople varias veces e incube a 55°C-60°C durante 10 minutos para disolver el ARN. Resuspender el precipitado en dH2O libre de RNasa, soplar aire varias veces e incubar a 55°C-60°C durante 10 minutos para disolver el ARN.
(8) Secar el ARN celular total extraído y añadir 50ul de agua. Añadir 10ul a 990ul de agua libre de RNasa y diluirlo 100 veces hasta 1ml. En una cubeta de cuarzo de 0,5 cm de espesor, use agua sin RNasa como control y use un espectrofotómetro UV 721 para detectar el resultado. El resultado debe ser: relación A260/280.