¿Puede algún experto proporcionar orientación detallada sobre los métodos y pasos específicos para usar placas Transwell para experimentos de quimiotaxis celular?

1 Materiales y métodos

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Matrigel: Becton Dickinson Compary, almacenado a -20 ℃

Placa Tanswell: Costar, EE. UU., #3422, el diámetro de los poros de la membrana de policarbonato es de 8 μm;

Colorante de hematoxilina, etanol en gradiente, solución de xileno.

1. 2 Preparación de quimiocinas: tomar las células NIH3T3 que crecieron bien el segundo día de paso y enjuagar suavemente dos veces con medio sin suero y cultivar a 37°C y 5; CO2 durante 24 h ~ 48 h, recoger el sobrenadante del cultivo celular; centrifugar a 4 ° C, 12.000 rpm durante 10 min, tomar el filtro sobrenadante y esterilizar con una alícuota de filtro de 0,22 μm y almacenar a -20 ° C;

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Preparación de la placa de cultivo Transwell Todas las operaciones deben realizarse de forma aséptica. Matrigel almacenado a -20°C se funde manteniéndolo en hielo entre 2°C y 8°C durante la noche. Utilice una punta de pipeta preenfriada para agregar 100 l de Matrigel a 300 l de medio sin suero helado y mezclar bien. Agregue 25 µl del Matrigel diluido anterior a la cámara de la placa Transwell, cubra toda la membrana de policarbonato e incube a 37 °C durante 30 minutos para permitir que Matrigel se polimerice en un gel. Las placas de cultivo Transwell recubiertas de Matrigel se pueden almacenar a 37 °C durante 2 semanas.

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Después de la estimulación mediante Matrigel Invasion Assay, las células de cada grupo se enjuagaron tres veces con PBS. Utilice medio libre de suero para preparar una suspensión de células individuales de manera convencional, 5 × 105 células/ml, y divida cada grupo de células en dos partes. Para la prueba de rechazo del azul de placenta, la viabilidad celular debe ser superior a 95. Agregue 100 l de suspensión celular (5 x 104 células) a la cámara de la placa de cultivo Transwell y agregue 200 l de medio libre de suero. Añadir 500 l de quimiocinas a la cámara inferior de la placa de cultivo Transwell e incubar a 37 ° C y 5 CO2 durante 24 h. Utilice un hisopo de algodón húmedo para limpiar suavemente las células de la superficie superior del gel Matrigel y la membrana de policarbonato. Retire con cuidado la cámara superior, átela con un hilo, márquela y fíjela con metanol helado durante 30 min. Tinción con hematoxilina durante 1 min. Deshidratación de etanol en gradiente (80, 95, 100), transparencia de xileno. Retire con cuidado la película de policarbonato de la base de la cámara superior y colóquela sobre un portaobjetos de vidrio para sellar con resina neutra. Las células adheridas a la superficie inferior de la membrana de policarbonato se contaron aleatoriamente en 6 campos visuales [1] bajo un microscopio de alta potencia (×400) y se calculó el promedio. Repita el experimento dos veces.

Nota 2.1

Quimiocinas preparadas a partir de células NIH3T3 y suero de ternera fetal. Las quimiocinas son un tipo de citocina que puede provocar que las células experimenten un movimiento quimiotáctico [2]. Actualmente, muchos laboratorios utilizan células NIH3T3 para preparar quimiocinas para experimentos de invasión celular in vitro, lo que lleva mucho tiempo y los pasos experimentales son engorrosos. Como todos sabemos, hay quimiocinas en el suero bovino fetal. Descubrimos en los experimentos de capacidad de invasión in vitro de células cancerosas de vesícula biliar HCCC29810 estimuladas por diferentes concentraciones de TNFα que las quimiocinas preparadas a partir de suero bovino fetal y células NIH3T3 se utilizaron para experimentos de invasión celular. in vitro El efecto es el mismo y el número de células migradas en los dos grupos es muy cercano. En términos de tiempo experimental, el ciclo de uso de células NIH3 T3 para preparar quimiocinas para experimentos de invasión celular in vitro es de 1 semana, mientras que el ciclo de uso de suero bovino fetal como quimiocinas para experimentos de invasión celular in vitro es de 2 días, lo que ahorra mucho. del tiempo experimental. Por tanto, se considera que el suero fetal bovino puede utilizarse para sustituir las quimiocinas producidas por las células NIH3T3.

2.2 Preparación celular Las células requeridas deben estar en la fase de crecimiento logarítmico y la viabilidad celular debe ser superior a 95. Si la viabilidad celular es baja, la capacidad de penetración celular se reducirá y los resultados experimentales se verán afectados.

2. 3 Limpie las células en la superficie superior del gel Matrigel y la membrana de policarbonato. Primero use un hisopo de algodón seco para absorber el líquido en la cámara superior y luego limpie suavemente el gel Matrigel con un paño. hisopo de algodón empapado en agua destilada y células en la superficie superior de la membrana de policarbonato. Si las células en la superficie superior de la membrana de policarbonato no se limpian, las células que no se hayan limpiado se incluirán en el recuento de células. Especialmente cuando las células son redondas, no podrá saber si son células que han pasado o no. En el caso de las células fusiformes largas, las células que han pasado tienen forma de huso largo y las células. Los que no han traspasado tienen en su mayoría forma de huso.

2.4 Tinción con hematoxilina: el tiempo para sumergir la cámara superior en hematoxilina nueva es de 1 min, y el tiempo para la hematoxilina que se ha utilizado muchas veces es de 2 min. Al estudiar el efecto inhibidor de la tetrandrina sobre la capacidad de migración de las células endoteliales de la vena umbilical humana HUVEC, el exceso de hematoxilina no se eliminó, sino que se deshidrató directamente y se volvió transparente, lo que resultó en un fondo borroso de las imágenes celulares y células poco claras (consulte la Figura 1). ). Al realizar experimentos sobre la capacidad de invasión in vitro de células cancerosas de vesícula biliar HCCC29810 estimuladas por diferentes concentraciones de TNFα, las colocamos en un vaso de precipitados lleno de agua del grifo y las enjuagamos varias veces para eliminar el exceso de hematoxilina antes de deshidratarlas y hacerlas transparentes. La imagen tiene un fondo limpio y celdas claras (consulte la Figura 2).