Resumen de los principios de la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia.

También conocida como tecnología PCR en tiempo real. Esta tecnología se basa en la PCR convencional y agrega una sonda fluorescente de doble marca marcada con dos grupos fluorescentes. Uno está marcado en el extremo 5' de la sonda llamado grupo indicador (Reporter, R); El extremo 3? de la aguja se llama grupo inhibidor de la fluorescencia o grupo extintor (Quencher, Q). Los dos pueden formar una estructura de transferencia de energía, es decir, la señal de fluorescencia emitida por el grupo R del terminal 5? El -OH en el extremo 3? ha sido bloqueado y no tiene la capacidad de extenderse. Cuando los cebadores de la sonda se amplifican mediante PCR no específica, la señal de fluorescencia no cambia. Después de que comienza la reacción de PCR, a medida que la cadena se alarga, la enzima Taq de la PCR cuantitativa de fluorescencia se mueve a lo largo de la plantilla de ADN hasta el sitio de unión de la sonda marcada con fluorescencia, ejerce su actividad exonucleasa 5?-3? y corta la sonda fluorescente. . Una vez cortado, el efecto inhibidor del grupo Q desaparece, lo que hace que aumente la señal de fluorescencia del grupo R. Existe una relación uno a uno entre el número de grupos R libres liberados y el número de productos de PCR, por lo que el efecto inhibidor del grupo Q desaparece, lo que provoca que la señal de fluorescencia del grupo R aumente. señal de fluorescencia del grupo R La intensidad es directamente proporcional a la cantidad de productos de la PCR. Una vez medido lo primero, se puede deducir lo segundo. Este es el principio de la PCR cuantitativa por fluorescencia. Durante el proceso de PCR, se detectan continuamente cambios en la señal de fluorescencia en el sistema de reacción cuando la señal aumenta hasta un cierto umbral (basado en el promedio y la desviación estándar de la línea base de la señal de fluorescencia, una señal de fluorescencia con un nivel de confianza de 99,7 mayor). (se calcula el valor promedio), es decir, el umbral), en este momento se registra el número de ciclos (ct). Existe una relación lineal estricta entre este parámetro del ciclo y el valor logarítmico de la cantidad inicial de ADN en el. Sistema de PCR Utilizando el valor ct del estándar de gradiente positivo, el sistema forma una curva estándar y el número de copias del ADN inicial se puede determinar con precisión en función del valor ct de la muestra.