Compartiendo información útil｜Tres generaciones de tecnología de secuenciación de regiones específicas para humanos

La tecnología de secuenciación de alto rendimiento de tercera generación se ha utilizado ampliamente en la investigación de enfermedades y cáncer, pero tiene limitaciones para detectar variaciones estructurales debido a su corta longitud de lectura. La tecnología de secuenciación de lectura larga de tercera generación representada por Pacbio y ONT ha compensado esta deficiencia, pero su costo relativamente alto limita su aplicación generalizada. La tecnología de secuenciación de regiones específicas de tercera generación no solo conserva las ventajas de la secuenciación de lectura larga, sino que también permite la secuenciación de alta profundidad de genes o regiones de interés a un precio más rentable. Actualmente, la tecnología de secuenciación de regiones específicas de tercera generación se ha aplicado a la investigación sobre HLA, STR, genes de fusión y detección de metilación en el campo de las enfermedades o el cáncer. Hay tres categorías principales de métodos de enriquecimiento de la región objetivo: amplificación por PCR de fragmentos largos, captura del objetivo CRISPR/Cas9 y captura con sonda en fase líquida. A continuación se los presentará uno por uno.

El método de amplificación por PCR de fragmentos largos es uno de los métodos de enriquecimiento dirigido al genoma comúnmente utilizados debido a su bajo costo de diseño de cebadores y proceso experimental estandarizado. Sin embargo, es probable que se produzcan quimerismo y sesgo de comparación de referencia durante la amplificación por PCR [1]. Además, las regiones complejas del genoma y las regiones con alto contenido de GC afectan fácilmente el efecto de la amplificación por PCR, lo que limita su alcance de aplicación. La amplificación por PCR de segmentos largos generalmente es adecuada para estudios de detección de variantes en regiones no complejas.

Se ha verificado el uso de la tecnología de secuenciación de nanoporos de lectura larga para la tipificación del antígeno leucocitario humano de clase I en el diagnóstico de rutina [2]

Publicado en: "Molecular Diagnostics" (IF 5) , Número 2, 2011. ¿Diagnóstico molecular (IF: 5.561)?

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El análisis de alta resolución de antígenos leucocitarios humanos (HLA) es el estándar de oro para determinar la compatibilidad paciente-donante para células madre hematopoyéticas trasplante. La secuenciación de lectura larga de nanoporos puede abarcar directamente la región HLA y proporcionar una tipificación inequívoca, pero la alta tasa de error de las bases limita su aplicación. En la primera etapa de este artículo, se seleccionaron 33 muestras con tipificación HLA conocida para realizar una amplificación de longitud completa específica de los genes HLA clase I HLA-A, HLA-B y HLA-C (consulte la Tabla 1 para ver los cebadores de amplificación). y se utilizó el kit de construcción de biblioteca MinION 1D2 (SQK-LSK308) para construir la biblioteca. Los resultados mostraron que los resultados de tipificación eran consistentes con los resultados de tipificación antes de la secuenciación Sanger 100 (Tabla 2). se muestra en la Figura 1. 1. Para verificar aún más el método, se seleccionaron 67 muestras clínicas para el análisis de secuenciación MinION en la segunda fase. Los resultados fueron consistentes con los resultados del análisis de datos de secuenciación de Sanger. Este resultado demuestra aún más que la tecnología de secuenciación de nanoporos ha desarrollado nanoporos de alto rendimiento. tecnología de secuenciación que se puede utilizar para el método de precisión de diagnóstico de rutina.

Tabla 1 Cebadores de amplificación

Tabla 2 Comparación de los resultados de tipificación de MinION y los resultados de tipificación de Sanger de 33 muestras (solo se muestran las primeras 3 filas)

Usar con Con la tecnología de captura dirigida Cas9, primero se desfosforila el extremo del ADN y luego se introduce una nueva muesca utilizando el complejo Cas9/ARN guía. El complejo Cas9/ARN guía conectará específicamente la conexión de secuenciación a la región cortada. Luego, el complejo Cas9/ARN guía une específicamente la ligadura de secuenciación a la región cortada, lo que permite una secuenciación dirigida. Esta tecnología elimina la necesidad de PCR e identifica simultáneamente variantes estructurales, STR y modificaciones de bases.

Secuenciación dirigida de nanoporos mediante ligadura de aptámeros guiada por Cas9 [3]

Publicado: Naute Biotechnology (IF: 54.9)

Publicado: 2020 abril de 2019

Los métodos de secuenciación actuales todavía están limitados por problemas como la incapacidad de detectar modificaciones de bases, longitudes de lectura demasiado cortas, altos requisitos totales de ácido nucleico, bajos rendimientos o procesos experimentales prolongados.

Los autores de este artículo desarrollaron un método de secuenciación dirigida de Cas9 con nanoporos (nCATS) basado en la captura dirigida de Cas9, que utiliza una estrategia de captura dirigida de ADN basada en CRISPR-Cas9 (Figura 2A) para realizar la lectura de nanoporos en la secuenciación del ADN capturado. El artículo demuestra que la tecnología nCATS puede identificar simultáneamente SNP, SV, haplotipos y metilación de CpG. El artículo encontró que la combinación de múltiples ARN guía aumentó la cobertura del gen KRT19 de 47 veces a 407 veces (Figura 2B), y la cobertura media de MinION de células completas aumentó a 680 veces (Figura 2C). El artículo comparó los SNV detectados por el método nCATS en la línea celular GM12878 con el conjunto de datos Platinum para verificar la precisión de la detección de SNP después del filtrado de datos bicatenarios. Los resultados mostraron que solo había una posición falsa positiva en el homólogo denso de timina. punto de polirregión. Los datos de metilación de nCATS se compararon con los datos de WGBS y mostraron una correlación de 0,81 por CpG. Este enfoque facilitará la aplicación de la tecnología de secuenciación de lectura larga en investigación médica y aplicaciones clínicas.

Personalice sondas específicas para genes o regiones de interés e hibride las sondas con ADN genómico para capturar y enriquecer fragmentos de la región objetivo para análisis de secuenciación e investigación. Sin embargo, esta técnica sufre la pérdida de información de modificación de bases debido a la amplificación por PCR durante la construcción de la biblioteca y requiere una consideración adicional del tiempo del ciclo para sondas personalizadas.

Secuenciación, ensamblaje y anotación eficiente de haplotipos KIR humanos [4]

Publicado en Frontiers in Immunology (7.561)

Fecha de publicación: octubre de 2012

La región del receptor tipo inmunoglobulina (KIR) de las células asesinas naturales tiene las características de alta homología, tasa de recombinación, polimorfismo y secuencias repetidas. El uso de la secuenciación de alto rendimiento de segunda generación no puede obtener información completa sobre el haplotipo. Este artículo propone un nuevo método para diseñar sondas de forma independiente para capturar regiones objetivo y utilizar secuenciación de lectura larga para ensamblar haplotipos KIR diploides humanos. Diseñamos 18 sondas de captura para capturar fragmentos de ADN de 2 a 8 kb de longitud en la región KIR. La secuenciación se realizó en el modo CCS de la plataforma PacBio Sequel y se ensambló utilizando el software Canu, que dividió las regiones por genes KIR en función de la longitud total de cada gen y KIR, y finalmente anotó la información posicional de la secuencia. Para evaluar la confiabilidad de este proceso, los autores evaluaron el ensamblaje y la anotación en 16 muestras (para las cuales se conocía información de haplotipos). Los resultados del ensamblaje mostraron que solo se utilizaron 18 sondas para capturar la región KIR, cubriendo el 97% del genoma de referencia con una identidad de secuencia de hasta el 99,97%. El método de secuenciación de captura de sonda dirigida propuesto en este estudio es el primer método para secuenciar y ensamblar completamente todos los diploides KIR en humanos, y puede aplicarse de manera efectiva a la investigación clínica y a escala poblacional.

En resumen, la tecnología de secuenciación de regiones objetivo de tercera generación tiene tres métodos de enriquecimiento de objetivos: método de amplificación por PCR, método de captura de objetivos Cas9 y método de captura en fase líquida con sonda. Sus ventajas y desventajas se resumen a continuación (Tabla 3). , se puede seleccionar de acuerdo con las necesidades de investigación específicas.

Tabla 3 Resumen comparativo de diferentes métodos de captura de objetivos

Referencias

[1] Laver TW, Caswell RC, Moore KA, et al. de secuenciación de lectura larga basada en amplicones[J]. Scientific?Scientific?2016;17(6):21746.?

[2]Matern BM, Olieslagers TI, Groeneweg M, et al. Secuenciación validada para la tipificación del antígeno leucocitario humano de clase I en diagnósticos de rutina[J].The Journal of Molecular Diagnostics.2020;22(7):912-919.?

[3]Gilpatrick T, Lee I, Graham JE, et al. Secuenciación de nanoporos dirigida con ligadura de adaptador guiada por Cas9[J].Naute Biotechnology.2020;38(4):433-438.?

[4]Roe D, Williams J, Ivery K, et al. Secuenciación, ensamblaje y anotación eficientes de haplotipos KIR humanos [J Frontiers in Immunology].