¿Las pruebas microbianas evalúan la cantidad de microorganismos o los metabolitos de los microorganismos?
Ambos métodos están disponibles
Los métodos para medir microorganismos son:
Método de medición de volumen: también conocido como método de concentración de micelio.
Refleja el estado de crecimiento de los microorganismos midiendo la cantidad de micelio contenido en un determinado volumen de solución de cultivo. El método consiste en tomar una cierta cantidad del medio de cultivo que se va a probar (como 10 ml) y colocarlo en un tubo de centrífuga graduado. Establecer un tiempo de centrifugación determinado (como 5 minutos) y una velocidad de rotación (como 5000 rpm). Después de la centrifugación, se vierte el Después de aclarar, se midió que el volumen del sobrenadante era v y la concentración de micelio era (10-v)/10. El método de medición de la concentración de micelio es un importante indicador de seguimiento del crecimiento microbiano en la producción de fermentación industrial a gran escala. Este método es relativamente extenso, simple y rápido, pero necesita establecer condiciones de procesamiento consistentes; de lo contrario, la desviación será grande. Dado que hay algunos nutrientes sólidos mezclados en el sedimento centrífugo, los resultados tendrán ciertas desviaciones.
Método de peso seco:
Se puede medir mediante centrifugación o filtración. Generalmente el peso seco es del 10-20% del peso húmedo. En el método de centrifugación, vierta un cierto volumen del medio de cultivo que se va a probar en un tubo de centrífuga, establezca un tiempo y velocidad de centrifugación determinados, centrifugue y centrifugue y lave con agua limpia de 1 a 5 veces antes de secar. El secado se puede realizar en estufa a 1050C o 1000C, o mediante secado por infrarrojos, o al vacío a 800C o 400C, y pesarse después del secado. Si se utiliza filtración, los hongos filamentosos se pueden filtrar con papel de filtro y las bacterias se pueden filtrar con membranas de acetato de celulosa y otras membranas. Después de la filtración, lavar con una pequeña cantidad de agua y secar al vacío a 400 ° C. El método de pesaje en seco es más engorroso. Este método se utiliza a menudo cuando los productos microbianos obtenidos son células bacterianas, como la levadura seca activa (ADY), y algunos piensos y fertilizantes que utilizan células microbianas como sustancias activas.
Método turbidimétrico:
El crecimiento de microorganismos provoca un aumento de la turbidez del cultivo. El estado de crecimiento de los microorganismos se puede juzgar midiendo el valor de absorbancia a una determinada longitud de onda utilizando un espectrofotómetro UV. Cuando se realiza un seguimiento regular del crecimiento bacteriano dentro de un cultivo, se puede utilizar un matraz Erlenmeyer especial con brazos laterales. Inserte el brazo lateral en el orificio del asiento colorimétrico del colorímetro fotoeléctrico y podrá medir su crecimiento en cualquier momento sin sacar la solución bacteriana. Este método se utiliza principalmente para el seguimiento del crecimiento celular en las industrias de fermentación. Por ejemplo, uso el espectrofotómetro UV-visible de UNICO y uso un tubo colorimétrico para medir regularmente el valor de absorbancia OD600 del caldo de fermentación a una longitud de onda de 600 nm para monitorear el crecimiento y el tiempo de inducción de E. Coli.
Método de medición de la longitud del micelio:
Para hongos filamentosos y algunos actinomicetos, la duración del crecimiento del micelio se puede medir en el medio de cultivo dentro de un cierto período de tiempo, o utilizando un fino Se inserta un tubo de vidrio con un extremo abierto y una graduación en un medio de cultivo adecuado, se coloca acostado y se inoculan los microorganismos en el extremo abierto. Después de un período de tiempo, se registra la longitud de crecimiento de las hifas para medir el crecimiento de los filamentos. microorganismos.
Método de recuento microbiano
Método del hemocitómetro:
El hemocitómetro es un portaobjetos de vidrio grueso con una estructura y un grosor especiales. Hay cuatro tiras en el portaobjetos. y dos crestas, con una ranura transversal corta y dos plataformas en el centro. Las superficies de las dos crestas son 0,1 mm más altas que las superficies de las dos plataformas. Cada plataforma está grabada con rejillas de diferentes especificaciones. grabado con 400 Cuadritos. Observando con un microscopio de aceite y contando la cantidad de microorganismos en una cuadrícula grande determinada, se puede calcular la cantidad de bacterias contenidas en 1 ml de líquido bacteriano. Este método es sencillo, intuitivo y rápido, pero sólo sirve para contar esporas producidas por microorganismos unicelulares o filamentosos, y el resultado que se obtiene es el número total de bacterias incluidas las células muertas.
Método de recuento por tinción:
Para compensar las deficiencias de que algunos microorganismos son difíciles de observar y contar bajo un microscopio de aceite, y el método del hemocitómetro no puede distinguir entre células muertas y células vivas directamente, la gente inventó el método de conteo por tinción. Al teñir adecuadamente las bacterias con diferentes tintes, es más fácil contar las bacterias viables bajo un microscopio. Por ejemplo, al contar células de levadura viables, puede utilizar una solución de tinción con azul de metileno. Después de la tinción, observe al microscopio que las células vivas son incoloras, mientras que las células muertas son azules.
Método de conteo proporcional:
Mezcla un líquido con una concentración conocida de partículas (como esporas de moho o glóbulos rojos) y un líquido bacteriano con una concentración de células que se medirá uniformemente en una cierta proporción y colóquelos en el campo de visión del microscopio. Contando sus números respectivos, se puede obtener la concentración celular de la solución bacteriana desconocida. Este método de conteo es relativamente tosco. Y es necesario preparar una suspensión con una concentración de partículas conocida como estándar.
Método de dilución líquida:
Realizar una dilución seriada diez veces de la muestra bacteriana desconocida. Según el número estimado, tomar 5 ml de cada una de las tres más adecuadas 10 veces. diluciones Inocular 1 ml de la muestra en 3 grupos de 15 tubos de ensayo que contienen medio de cultivo. Después de la incubación, registre el número de tubos de ensayo que muestran crecimiento en cada dilución y luego verifique la tabla de números de probabilidad máxima MPN (número más probable) para obtener. el resultado. El número de bacterias contenidas en la muestra bacteriana se calcula en función del factor de dilución de la muestra. Este método se utiliza a menudo para la detección de microorganismos en los alimentos, como la inspección del límite microbiano del agua potable y la leche.
Método de recuento de colonias en placa:
Este es el método más utilizado para contar bacterias viables. Realice una dilución en gradiente del líquido bacteriano que se va a analizar, tome un cierto volumen del líquido bacteriano diluido y mézclelo uniformemente con el medio de cultivo sólido apropiado antes de la solidificación, o extienda el líquido bacteriano en la placa de medio de cultivo sólido solidificado. Después de la incubación, multiplique el número de colonias en la placa por la dilución de la solución bacteriana para calcular el número de bacterias en la solución bacteriana original. Generalmente, es apropiado tener entre 50 y 500 colonias en una placa con un diámetro de 9 cm. Sin embargo, el método es más problemático y requiere operadores expertos. El método de recuento de colonias en placa no solo puede obtener la cantidad de bacterias viables en la solución bacteriana, sino también aislar y cultivar las bacterias en la solución bacteriana para obtener clones individuales.
Método del papel reactivo:
Basado en el método de recuento en placa, se han desarrollado pequeños productos comerciales para un recuento rápido. Las formas incluyen pequeñas hojas gruesas de papel de filtro, hojas de agar, etc. Succionar el medio de cultivo apropiado en el papel de filtro y las tabletas de agar, agregar el indicador de actividad cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC, incoloro), sumergirlo en el líquido bacteriano de prueba y colocarlo en una bolsa de embalaje sellada. Después de un cultivo a corto plazo, aparece una cierta densidad de pequeñas colonias de color rosa en el papel de filtro y, en comparación con el patrón de la placa de papel de color estándar, se puede estimar el contenido bacteriano de la muestra. El recuento mediante el método del papel reactivo es rápido y preciso y, en comparación, evita los errores operativos humanos del método de recuento en placa.
Método de filtración por membrana:
Utilice una membrana de filtro especial para filtrar un cierto volumen de muestras que contienen bacterias, teñirlas con naranja Yading y observar la fluorescencia de las células bajo luz ultravioleta. microscopio. Las células vivas emitirán una fluorescencia naranja, mientras que las células muertas emitirán una fluorescencia verde.
Los productos medibles incluyen:
Método de indicadores fisiológicos:
El crecimiento de microorganismos va acompañado de cambios en una serie de indicadores fisiológicos, como el pH, el contenido en El caldo de fermentación Existen muchos indicadores fisiológicos paralelos al crecimiento, como el contenido de nitrógeno, el contenido de azúcar, la producción de gas, etc., y pueden usarse como valores relativos para medir el crecimiento.
Medición del contenido de nitrógeno:
El contenido de nitrógeno de la mayoría de las bacterias es del 12,5% del peso seco, el de la levadura del 7,5% y el del moho del 6,0%. Según el contenido de nitrógeno × 6,25, se puede determinar el contenido de proteína bruta. Existen muchos métodos para medir el contenido de nitrógeno, como los métodos de digestión con ácido sulfúrico, ácido perclórico, ácido yódico, ácido fosfórico y el método de medición de gas Dumas N2. El método de medición del gas N2 de Dumas consiste en mezclar la muestra con CuO, calentarla en el flujo de gas CO2 para generar nitrógeno y recogerla en el respirómetro. Después de absorber el CO2 con KOH, se puede medir la cantidad de N2.
Determinación del contenido de carbono:
Mezclar una pequeña cantidad (peso seco 0,2-2,0 mg) de material biológico en 1 ml de agua o tampón inorgánico y añadir 2 ml de 2%. Solución de K2Cr2O7 en Calentar a 100°C durante 30 minutos y luego enfriar. Agregue agua para diluir a 5 ml y lea el valor de absorbancia a una longitud de onda de 580 nm para calcular la cantidad de crecimiento. Es necesario utilizar reactivos como controles en blanco y muestras estándar como curvas estándar.
Método de determinación del azúcar reductor:
El azúcar reductor generalmente se refiere a monosacáridos u oligosacáridos, que pueden ser utilizados directamente por los microorganismos. La medición de los azúcares reductores puede reflejar indirectamente el estado de crecimiento de los microorganismos. Se utiliza comúnmente para el monitoreo rutinario del crecimiento microbiano en la producción de fermentación industrial a gran escala. El método consiste en centrifugar el caldo de fermentación, tomar el sobrenadante, agregar reactivo de Fehling, hervir al baño maría durante 3 minutos, sacar y agregar un poco de ácido clorhídrico para acidificar, agregar Na2S2O3 al acercarse al punto final, agregar solución de almidón, Continúe agregando Na2S2O3 hasta el punto final; consulte la tabla para leer el contenido de azúcar reductor.
Medición de nitrógeno amino:
El método consiste en centrifugar el caldo de fermentación, tomar el sobrenadante, añadir rojo de metilo y ácido clorhídrico como indicadores y añadir NaOH 0,02 N para ajustar el color. Justo después de que se desvanezca, agregue 18% de formaldehído neutro como sustrato, reaccione durante unos segundos, agregue 0,02 N para que cambie de color y calcule el contenido de nitrógeno amino en función de la cantidad de NaOH. Según el contenido de nitrógeno amino en la solución de cultivo, puede reflejar indirectamente el estado de crecimiento de los microorganismos.
Determinación de otras sustancias fisiológicas:
P, ADN, ARN, ATP, NAM (ácido acetilmurámico) y otros contenidos así como producción de ácido, producción de gas, producción de CO2 (etiquetado con glucosa como sustrato), el consumo de oxígeno, la viscosidad, la producción de calor y otros indicadores se pueden utilizar para medir el crecimiento. El crecimiento de microorganismos también puede reflejarse en función de los cambios en la concentración del sustrato antes y después de la reacción, la producción final de gas y la actividad microbiana. Por ejemplo, en la producción de fermentación de BMP-2, controlo los cambios en el oxígeno disuelto y el pH en cualquier momento para juzgar el crecimiento de bacterias.
Método comercial de detección microbiana rápida:
La dirección de desarrollo de la detección microbiana es rápida, precisa, simple y automatizada. Actualmente, muchas empresas de productos biológicos utilizan principios tradicionales de detección microbiana y combinan diferentes bases. En cuanto a los métodos de detección, se han diseñado diversas formas de instrumentos y equipos de detección microbiana, que gradualmente se están utilizando ampliamente en los campos de la detección microbiana médica y la investigación científica. Por ejemplo:
1. La combinación de un medio de cultivo antiinterferencia y una tecnología de detección rápida de cantidades microbianas resuelve problemas que los métodos tradicionales de detección microbiana no pueden resolver, sentando una base sólida para el establecimiento de un sistema microbiano antiinterferencia completo. sistema de detección. El medio de cultivo microbiano antiinterferencias, los nuevos tubos de identificación bioquímica, las tarjetas de recuento de microbios, los kits de prueba de calidad ambiental, etc. proporcionados por la División de Industria Cooperativa de la sucursal de Guangzhou de la Academia de Ciencias de China se pueden utilizar convenientemente para múltiples pruebas.
2. El recuento bacteriano total totalmente automático del BACTOMETER y el sistema rápido de detección de bacterias pueden obtener resultados de monitoreo en unas pocas horas. El color y las características ópticas de la muestra no afectan la lectura. y detección de moho. El principio es que el método de impedancia eléctrica (TECNOLOGÍA DE IMPEDANCIA) se utiliza para colocar la muestra a analizar y el medio de cultivo en un kit de reacción. Hay un par de electrodos de acero inoxidable en la parte inferior para medir los cambios de impedancia causados. por crecimiento microbiano. Por ejemplo, cuando los microorganismos crecen, los nutrientes macromoleculares en el medio de cultivo pueden metabolizarse en pequeñas moléculas activas. El método de impedancia eléctrica puede probar este cambio sutil, monitoreando así la presencia y la cantidad de microorganismos más rápidamente que el método de placa tradicional. Los elementos de medición incluyen recuentos bacterianos totales, levaduras, coliformes, mohos, lactobacilos, termófilos, bacterias gramnegativas, Staphylococcus aureus, etc.