Varios conceptos del cultivo de células madreJin·(Hefei 230036, Facultad de Ganadería y Pesca, Universidad Agrícola de Anhui) Desde que Evans y Kaufman (1981) aislaron células madre embrionarias de ratón a partir de embriones de implantación retardada ( Células ES), ¿las células ES han estado atrayendo la atención de la gente [1]? . Desde 65438 hasta 0998, después de que el grupo de investigación Thomson, financiado por Keelung, publicara una serie de trabajos sobre el establecimiento de células ES humanas en la revista Science, las acciones de Keelung se multiplicaron por 6. Durante 1999 y 2000, la revista estadounidense Science recomendó dos veces la investigación con células madre como el campo de investigación más importante del siglo XXI. Del 65438 al 0999, la revista estadounidense "Science" también clasificó la investigación con células madre entre los diez mayores logros científicos del mundo ese año. Esto es suficiente para ilustrar el encanto de las células madre. La razón principal por la que las células madre atraen la atención de la gente es porque son células totipotentes que pueden diferenciarse espontáneamente en estructuras multicelulares, es decir, cuerpos embrionarios (EB). La EB contiene tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo. Los cuerpos embrionarios pueden continuar diferenciándose en una variedad de tipos de células, incluidas células sanguíneas, células endoteliales, células musculares y neuronas. Además, las células ES tienen perspectivas atractivas en la producción de clonación animal, la producción de animales transgénicos, los modelos de investigación de enfermedades y la producción de fármacos. Este artículo explica principalmente la aplicación de células madre embrionarias en la producción de animales clonados. ? 1 ¿Cuál es la base teórica de la clonación de células ES? Las células madre embrionarias son células aisladas de la masa celular interna y de las células germinales primordiales de los embriones tempranos. Es totipotente o pluripotente y puede convertirse en células precursoras de cualquier tejido u órgano, y luego desarrollarse a partir de células precursoras en células funcionales. Las células ES normales pueden diferenciarse en dos células madre hijas, o una célula madre hija y una célula funcional. Esta diferenciación se ve afectada por la regulación endógena de las células madre (principalmente por proteínas estructurales y factores polipeptídicos en las células madre) y la regulación exógena (principalmente por las células del tejido circundante y la matriz extracelular). Recientemente, Amato Giaccia descubrió que el contenido de oxígeno controla la diferenciación de las células madre, lo que proporciona pistas útiles para una mayor utilización de las células madre. Otro descubrimiento importante es que Andrew E. Wurmser y otros descubrieron que las células madre de tejidos maduros sólo se fusionan con células existentes para formar otros tejidos, en lugar de crear nuevas células. Por lo tanto, el uso de células madre de tejidos maduros tenderá a ser más cauteloso. [2]? . Esto también mejora aún más el papel de las células ES. ? Otra característica de las células ES es que pueden proliferar, clonarse, congelarse y conservarse in vitro como células somáticas normales sin diferenciación. Esto proporcionará a las personas una gran cantidad de células ES disponibles. Por ejemplo, cada animal de experimentación puede proporcionar de 5000 a 6500 PGC a la vez, que luego pueden cultivarse en células similares a ES in vitro. Ahora las personas pueden cultivar células madre embrionarias in vitro hasta 40 a 60 generaciones sin diferenciación. Una cantidad tan grande de células ha sentado las bases para nuestro uso. ? Las células madre embrionarias son procesables. In vitro, las personas pueden realizar manipulación y selección genética, como transgénesis, selección de genes, captura de genes y una serie de otras tecnologías, combinadas con tecnología de transferencia nuclear, para producir los animales que desean. ? ¿Es factible clonar 2 células ES? El principio de la tecnología de clonación es trasplantar núcleos de células de donantes en ovocitos enucleados y activar la reprogramación para producir nuevos individuos. Actualmente, los clones de células somáticas tienen dos problemas en comparación con las células ES: primero, las células somáticas son propensas a mutar in vitro. Para evitar este inconveniente, se suelen utilizar células recientemente aisladas o pasadas. El segundo trata sobre dónde seleccionar las celdas. En la actualidad, la gente ha utilizado células mamarias, células de cúmulo, células de las trompas de Falopio, fibroblastos de la piel, células epiteliales del útero, células musculares, células de sostén, células del hígado, fibroblastos del oído, células epiteliales de la mama en el calostro, etc. Pero hasta ahora no se han encontrado las células somáticas más adecuadas para el trasplante nuclear. Algunas de las células utilizadas para la transferencia nuclear provienen de fetos, generalmente fibroblastos, y otras provienen de animales adultos. Esto se debe principalmente a que, aunque en teoría cada célula del cuerpo se divide y diferencia a partir de un óvulo fertilizado, y la información del ADN se transmite completamente en el cuerpo a través de una replicación semiconservadora, desde un óvulo fertilizado a cientos de millones de células en el cuerpo. , los genes individuales en algunas células pueden perderse o reordenarse irreversiblemente. Cuando estas células se utilizan como donantes nucleares, no se puede garantizar la integridad de la información. Esto también puede ser una de las razones de la baja eficiencia de la clonación celular, la muerte o anomalías después del nacimiento.

Aunque la transferencia nuclear de células ES también requiere reprogramación en óvulos enucleados, la eficiencia de clonación de las células ES es mucho mayor que la de la clonación de células somáticas, que es ineficiente y propensa al aborto durante el embarazo, y la reprogramación de las células ES también es mucho más fácil. . También se plantea la hipótesis de que la mayoría de los núcleos donantes utilizados por los individuos clonados supervivientes son los de células madre adultas derivadas de tejido animal en lugar de los de células terminalmente diferenciadas. . ? Con la profundización de la investigación sobre las células ES, las personas han obtenido descendencia del trasplante nuclear de células ES en muchos animales. Teruhiko Wakayama et al. clonaron 31 ratones a partir de células ES de ratón que habían sido pasadas durante más de 30 generaciones, de los cuales 14 sobrevivieron [4]. Campbell (1996, 1995) inyectó ovejas y cabras similares a ES en ovocitos enucleados respectivamente, obtuvo embriones reconstruidos y produjo ovejas vivas después de la transferencia nuclear [5]? . Michelle Sims y N. L First (1993) trasplantaron los núcleos de células ICM bovinas cultivadas durante 6 a 101 días en ovocitos enucleados. La tasa de escisión fue del 70% y la tasa de blastocistos fue del 24%. Después de la transferencia de embriones, 13 vacas quedaron preñadas y 4 parieron. Los embriones reconstruidos de Stice (1996) se obtuvieron mediante transferencia nuclear de células madre embrionarias bovinas, se trasplantaron al útero bovino receptor y se desarrollaron hasta los 45 días [7]? Chibeli utilizó tecnología transgénica para obtener ganado de línea germinal quimérica; Shim (1997) y Piedrahita (1998) establecieron una línea de células madre pluripotentes a partir de PGC porcinas y obtuvieron cerdos quiméricos. ? 3 ¿Cuál es la importancia de la clonación de células ES? El significado más básico de la transferencia nuclear de células ES es que si la transferencia nuclear puede producir descendencia completa con las mismas características genéticas que sus padres, entonces simplemente prueba que la célula ES es una célula totipotente. La clonación de células ES es lo mismo que la clonación de células somáticas. Al obtener una gran cantidad de células de donantes con las mismas características genéticas que sus padres y luego utilizar la tecnología de transferencia nuclear, se puede mejorar la eficiencia reproductiva de individuos destacados y expandir rápidamente la población de. personas destacadas y hacer contribuciones a la producción ganadera. Una gran contribución. Para especies raras o en peligro de extinción, esta tecnología ofrece la oportunidad de salvar las especies raras o en peligro de extinción. Es más fácil utilizar la manipulación genética a nivel de células madre embrionarias que utilizar transgenes a nivel de óvulos fertilizados, y las personas pueden obtener los animales transgénicos que necesitan. Luego se podrá utilizar la tecnología de transferencia nuclear para obtener una gran cantidad de individuos con esta expresión genética, lo que también es una excelente oportunidad para crear nuevas especies. Debido a que las células ES tienen la propiedad de fusionarse espontáneamente, pueden operar a nivel celular para crear nuevas especies, lo que puede no ser posible mediante el apareamiento natural. Los genes de GH de ganado vacuno, ovino y humano se introdujeron sucesivamente en el genoma del ratón, y los ratones transgénicos obtenidos durante el período de rápido crecimiento crecieron cuatro veces más rápido que el grupo de control. Además, mediante la transferencia nuclear de células madre embrionarias se puede obtener un gran número de descendientes homogéneos a la vez, lo que proporciona un buen modelo para la investigación biológica. 4¿Qué problemas existen actualmente? Dado que el descubrimiento de las células ES tiene sólo más de 20 años, la comprensión que la gente tiene sobre ellas es limitada, lo que limita su utilización. En la actualidad, en lo que respecta a la transferencia nuclear de células madre, existen principalmente los siguientes problemas: 4.1 La propia tecnología de transferencia nuclear todavía tiene muchas teorías que mejorar, la eficiencia de la transferencia nuclear es todavía muy baja, el desarrollo y la implantación de embriones reconstruidos , y la interacción y coordinación del núcleo y el citoplasma. Las teorías aún deben estudiarse más a fondo. ? 4.2 La tecnología para establecer líneas de células madre embrionarias aún no está madura. La capa alimentadora ampliamente utilizada actualmente está hecha de línea ilimitada de fibroblastos de ratón (STO) o fibroblastos embrionarios de ratón (PMEF), utilizando principalmente el factor de crecimiento FGF secretado por sus células y el factor LIF que inhibe la diferenciación celular** *Para evitar que las células madre clonación in vitro sin diferenciación, y luego agregar algunas otras sustancias. Aun así, la eficiencia actual del establecimiento de linajes todavía no es muy alta, especialmente en China, donde no hay muchos animales similares a ES disponibles y el número de pasajes es pequeño. En la actualidad, la gente intenta utilizar otros medios de cultivo, como el medio condicionado con fibroblastos de rata, el medio epitelial de las trompas de Falopio de cabra, el medio epitelial de las trompas de Falopio de oveja, el medio epitelial uterino de oveja, el medio epitelial uterino de cabra, el medio de células de la granulosa bovina, el medio de cultivo de células de la granulosa bovina , Medio de cultivo de fibroblastos uterinos, testículo fetal bovino, medio de cultivo de fibroblastos de riñón e hígado. Meinecke Tillmann (1996) descubrió que los fibroblastos fetales bovinos son beneficiosos para la proliferación de células ICM y ES de oveja. Piedrahitat et al. utilizaron fibroblastos fetales porcinos y células epiteliales como capas alimentadoras, pero fracasaron. Strojek et al. (1990) creían que la capa alimentadora de fibroblastos uterinos porcinos podría promover la adhesión de blastocistos y la formación de clones de ICM.