¿Cómo hacer que las células nerviosas cultivadas primarias sean más puras?

1. Equipo quirúrgico estéril

2. Incubadora de CO2 de equipo grande: 5% temperatura constante, 10% CO2 para mantener el valor del pH en el medio de cultivo.

Microscopio invertido: observa cada día el crecimiento de las células adherentes.

Microscopio de disección para un muestreo preciso.

Refrigerador de temperatura normal: -4 ℃, utilizado para almacenar diversos fluidos de cultivo, fluidos de disección y pegamento de cola de rata.

Refrigerador de baja temperatura: -20 ℃ -80 ℃, utilizado para conservar enzimas séricas, objetos de valor y reactivos.

Horno eléctrico: utilizado para la esterilización de cristalería.

Autoclave: se utiliza para esterilizar placas de Petri e instrumental quirúrgico.

Filtración: Preparar líquido de disección y líquido de cultivo, que deben filtrarse y esterilizarse antes de su uso.

Osmómetro, reactivo de pH, balanza, etc.

3. Utensilios culturales e instrumentos quirúrgicos

1 Placa de Petri: comúnmente se utilizan placas de Petri de plástico y vidrio de 35 mm, y el diámetro de los materiales anatómicos es de 15 mm a 90 mm.

Se pueden utilizar 2 placas de cultivo, de 24 a 40 pocillos, para cultivo abierto.

3 frascos de cultivo:

4 pajitas, de uso común de 1, 5, 10 ml, se deben remojar en ácido, lavar y esterilizar antes de su uso.

5 contenedores de medio de cultivo variados

6 pequeños instrumentos quirúrgicos

Preparación:

1. Preparar el medio de cultivo

(1) Solución de disección: preparar tampón PBS con sales inorgánicas (excepto Ca2+ y Mg2+) y glucosa, y mantener una cierta presión osmótica y valor de pH.

(2) Medio básico (MEM): Compuesto principalmente por diversos aminoácidos, disueltos en glucosa y agua bidestilada.

(3) Medio de cultivo de inoculación: se utiliza para dispersar células digeridas con tripsina para preparar una suspensión celular. Su composición es MEM que contiene un 1% de glutamina y le añade un 10% de suero de caballo, que se prepara el mismo día.

(4) Mantenimiento del medio de cultivo: 24 horas después de la inoculación, reemplazar todos los medios de cultivo, y luego reemplazarlos cada 2 semanas, 1/2 cada vez. Su composición es MEM que contiene un 5% de suero de caballo, un 1% de glutamina y cantidades adecuadas de nutrientes auxiliares.

En segundo lugar, el medio de cultivo suele ser cola de cola de rata, cola de cuero de vaca y polilisina, y luego se gelatiniza.

3. Conservar placas de Petri estériles para su uso posterior. Todos los recipientes de cultivo deben enjuagarse con agua limpia durante 2-3 días, hasta 2 veces con ddH2O, 3-4 veces cada vez, rellenarse y empaquetarse, secarse y esterilizarse en un horno, 1 día antes del cultivo.

Cultivo de dispersión de células nerviosas

(1) Utilice tejido neural de uso común de animales embrionarios o ratas recién nacidas. Los embriones de pollo suelen ser ratas recién nacidas de 6 a 8 días de edad o fetos de ratones (12 a 14 días) o embriones humanos. Sin embargo, algunas personas piensan que está relacionado con la organización. Por ejemplo, 19d es adecuado para embriones de rata, 18d es adecuado para ratones y 10d es adecuado para cuerpo estriado de rata si los embriones de rata se cultivan conjuntamente con cuerpo estriado y sustancia negra, 13d es adecuado para sustancia negra y 18-21d es adecuado; para el cuerpo estriado; el cerebelo es un embrión de ratón de 20 a 21 días, con una alta tasa de supervivencia de células de Purkinje y células granulares en proceso de diferenciación. El cocultivo de médula espinal y GRD, generalmente embriones de pollo de 4 a 7 días o embriones de ratón de 12 a 14 días, es fácil de obtener y tiene una alta tasa de supervivencia nerviosa.

(2)Materiales de dibujo. El tejido correspondiente se extrajo del cerebro, se cortó en pedazos en líquido de disección y se digirió con enzimas pancreáticas. La médula espinal se fijó en una placa de agar, se dividió en lados dorsal y ventral con un cuchillo y se cultivó por separado.

(3) Aislamiento y siembra celular. El tejido nervioso se incubó con tripsina al 0,1,25-0,25 % a 37 °C durante 30 minutos, luego se trasladó a la solución de inoculación, se detuvo la digestión, se lavó la solución de tripsina y se utilizó una pipeta de boca fina para soplar la suspensión celular hasta su tope. dispersarlo, y así sucesivamente varias veces. Después de la precipitación, aspirar la suspensión celular superior, contar, preestablecer la densidad celular e inocular en una placa de cultivo (1x60).

(4) Inhibe el crecimiento de las células gliales. Después de 3 a 5 días de cultivo, algunas personas piensan que después de 7 días de cultivo, se puede usar citarabina o 5-FU para inhibir el crecimiento de células gliales.

(5) Observación. 6-12 horas después de la inoculación, las células comenzaron a adherirse a la pared y a agregarse. El proceso de crecimiento celular fue evidente y las células gliales proliferaron significativamente en 5 a 7 días. Entre los 7 y 10 días, las células gliales se cortan debajo de las células nerviosas, formando una alfombra. A las 2 semanas, las células nerviosas crecen con mayor vigor y tienen un halo evidente a su alrededor. Al cabo de un mes, algunas células nerviosas comenzaron a degenerar, deformarse e incluso aparecer vacuolas. Generalmente cultivado durante 2 años.

Sin embargo, las células nerviosas sólo pueden crecer, no multiplicarse. Sólo pueden ser primarios, no pueden pasar y no tendrán ciclo celular. Y a medida que aumenta el tiempo de cultivo, la cantidad de células disminuye, pero las células gliales pueden hacerlo, al igual que las células gliales. Durante el proceso de cultivo, mueren más células nerviosas en los primeros días 9-12. Esta es la primera etapa de muerte. Se debe tener cuidado para mantener las condiciones constantes. Las células supervivientes suelen tener procesos largos y numerosos y forman sinapsis entre sí.

(6) Los experimentos de cultivo celular comúnmente utilizados incluyen: análisis de proteínas totales mediante FCM; análisis de patch-clamp y canales iónicos: análisis inmunohistoquímico:

Pero el análisis inmunohistoquímico requiere Tenga en cuenta que los anticuerpos actúan directamente. en las células vivas y no pueden penetrar fácilmente en las células vivas. Por lo tanto, al localizar antígenos nucleares, primero se debe considerar la permeabilidad de la membrana a los anticuerpos. Comúnmente se utilizan agentes químicos para aumentar su permeabilidad o para resolverlo por congelación.

En inmunohistoquímica u otras tinciones histológicas, a menudo se utilizan diferentes métodos de tinción para distinguir diferentes células, como el marcado obvio de las células dendríticas con galactocerebrósido; el marcado obvio de los astrocitos con GFAP tiene una tinción especial. Esto tiene un importante valor de aplicación para estudiar la función de las células gliales en el sistema nervioso. Las células gliales han sido ignoradas en el pasado y desempeñan un papel importante en las enfermedades cerebrovasculares (como la lesión isquémica), las enfermedades degenerativas (como la EA, la EP) y el llenado de las células gliales después de una lesión. También es la base material para la función de las células nerviosas y el apoyo nutricional.