¡Urgente! ¡Preguntas sobre la secuenciación del ADN!
Tecnología de secuenciación de ADN
En la investigación de biología molecular, el análisis de secuencia de ADN es la base para futuras investigaciones y modificación de genes diana. Las principales técnicas utilizadas actualmente para la secuenciación son el método de terminación de cadena didesoxi inventado por Sanger et al (1977) y el método de degradación química inventado por Maxam y Gilbert (1977). Los dos métodos son muy diferentes en principio, pero ambos se basan en nucleótidos que comienzan en un punto fijo y terminan aleatoriamente en una base específica, produciendo así una serie de nucleótidos de diferentes longitudes, a saber, A, T, C y G. Actualmente, la secuenciación de Sanger se utiliza ampliamente.
El principio de la secuenciación de Sanger es utilizar la ADN polimerasa para extender cebadores que se unen a una plantilla de la secuencia que se va a probar. Este proceso continúa hasta que se agrega el nucleótido que termina la cadena. Cada método de secuenciación consta de un conjunto de cuatro reacciones independientes, cada una de las cuales contiene los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y una cantidad diferente de un didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP). Debido a que el ddNTP carece del grupo 3-OH necesario para la extensión, permite que los oligonucleótidos extendidos terminen selectivamente en los sitios G, A, T o C. El punto de terminación está determinado por el didesoxígeno correspondiente en la reacción. Las concentraciones relativas de cada dNTP y ddNTP se pueden ajustar de modo que la reacción produzca un conjunto de productos de terminación de cadena de cientos a miles de bases de longitud. Tienen el mismo punto de partida pero terminan en diferentes nucleótidos y pueden separarse en fragmentos de diferentes tamaños mediante electroforesis en gel desnaturalizante de alta resolución. Después del procesamiento del gel, pueden detectarse mediante radiografía o rayos X. fragmentos.
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Descripción general:
El sistema de secuenciación de ADN SILVER SEQUENCETM de Promega es un sistema de secuenciación no radiactivo que puede detectar bandas en el gel. . La tinción con plata es más rápida y menos costosa que los métodos radiactivos o fluorescentes. Los resultados de la secuenciación están disponibles el mismo día; las secuencias se pueden leer dentro de los 90 minutos posteriores a la electroforesis, lo que no es posible con los métodos de secuenciación radiactiva tradicionales. Además, el sistema SILVER SEQUENCETM utiliza oligonucleótidos 5'OH no modificados como cebadores, lo que reduce el gasto de oligonucleótidos especialmente modificados. El sistema no requiere la manipulación cuidadosa de los isótopos que requieren los métodos radiactivos, ni los costosos reactivos que se encuentran en las técnicas de fluorescencia o quimioluminiscencia. Además, no requiere instrumentación para detectar bandas de secuencia como la mayoría de los métodos de fluorescencia.
La ADN polimerasa Taq es extremadamente termoestable a 95°C. La ADN polimerasa Taq de grado de secuenciación utilizada en este sistema es una modificación de la ADN polimerasa Taq que es muy efectiva en plantillas de ADN bicatenario con alta precisión, produciendo bandas uniformes con fondo bajo.
El sistema SILVER SEQUENCETM contiene una mezcla de nucleótidos modificados como el 7-deaza dGTP (7-deaza dGTP, o dITP), un dGTP de reemplazo que elimina la compresión de bandas causada por regiones ricas en GC.
La temperatura de recocido es el factor más importante en la secuenciación del ciclo térmico. Las temperaturas de recocido demasiado altas reducirán la estructura secundaria de la plantilla. Mejore la rigurosidad del emparejamiento de imprimación y plantilla. Por otro lado, la reasociación de cadenas y la estructura secundaria de la plantilla limitan la capacidad de obtener datos de secuencia claros para productos de PCR pequeños (500 pb). La extensión del cebador comienza con la fase de recocido de cada ciclo. A temperaturas más bajas, la polimerasa puede encontrar regiones de estructura secundaria más fuerte, lo que hace que la polimerasa se disocia. Las bandas tienen entonces la misma posición relativa en los cuatro carriles de electroforesis. Por lo tanto, se debe utilizar la temperatura de recocido más alta posible. Para plantillas con estructura secundaria fuerte, se recomienda un patrón cíclico de desnaturalización a 95 °C y recocido/extensión a 70 °C. En general, los cebadores más largos y los cebadores con alto contenido de GC producirán señales más fuertes.
Los resultados experimentales muestran que los cebadores de 24 unidades con un contenido de GC de aproximadamente 50 funcionan mejor.
Debido a que este sistema utiliza un termociclador, tiene las siguientes ventajas en comparación con los métodos de secuenciación tradicionales: (1). Este método amplifica linealmente el ADN molde para producir suficiente producto para permitir la detección de bandas de secuencia mediante técnicas de tinción con plata, y la reacción de secuenciación requiere entre 0,03 y 2 pmol de ADN molde (dependiendo del tipo de molde). (2) La alta temperatura en cada ciclo de desnaturalización reemplaza los procesos de desnaturalización de bases y precipitación con etanol de la plantilla de ADN bicatenario (ADNds), y el ciclo de desnaturalización también ayuda a eliminar las plantillas de ADNds lineales (como los productos de reacción de PCR) debido a. Surgen problemas de rápida recondensación. (3). La reacción de la polimerasa a alta temperatura debilitará la estructura secundaria de la plantilla de ADN, permitiendo que la polimerasa pase a través de la región de la estructura altamente secundaria.
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II. Materiales
ADN purificado a analizar, ya sea monocatenario o bicatenario.
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3. Instrumentos
Aparatos de electroforesis de alto voltaje, tanques de electroforesis para secuenciación, equipos de fabricación de geles y máquinas de PCR.
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IV.Reactivos
[Editar este párrafo reactivos
(1) Kit de secuenciación de ADN SILVER SEQUENCETM.
(2) Solución madre de acrilamida y metacrilamida (38 acrilamida p/v, 2 metacrilamida p/v): 95 g de acrilamida, 5 g de metacrilamida disueltos en 140 ml doble Diluir a 250 ml en agua al vapor, filtrar 0,45 mm, almacenar en una botella marrón y conservar en el frigorífico a 4 grados centígrados durante 2 semanas.
(3) Se disuelven 10 persulfato de amonio, 0,5 g de persulfato de amonio en 4 ml de agua y se ajusta el volumen a 5 ml. Debe prepararse y usarse inmediatamente.
(4) Tampón 10×TBE (1 mol/l Tris, 0,83 mol/l ácido bórico, 10 mmol/l EDTA): 121,1 g Tris, 51,35 g ácido bórico, 3,72 g Na2 EDTA -2H2O, disuelto En agua bidestilada hasta 1 litro se puede almacenar a 4°C durante 2 semanas y su valor de pH es de aproximadamente 8,3.
(5) 10 persulfato de amonio, 0,5 g de persulfato de amonio disueltos en 4 ml de agua, diluidos a 5 ml, deben estar frescos.
(5) Tampón de electrodo TBE: diluya 10 × tampón TBE a 1 × TBE para su uso posterior.
(6) TEMED
(7) Solución fijadora/parada: Preparar 2 litros de ácido acético glacial 10 (V/V) para su uso posterior.
(8) Solución colorante: 2 gramos de nitrato de plata, 3 ml de formaldehído, disueltos en 2 litros de agua ultrapura y reservar.
(9) Revelador: 60 gramos de carbonato de sodio (Na2CO3), disueltos en 2 litros de agua ultrapura, añadir 3 ml de 37 formaldehído y 40 ml de solución de tiosulfato de sodio (10 mg/ml) antes de su uso. .
(10) 95 etanol.
(11) 0,5 de ácido acético glacial.
(12) Sigmacote (Sigma CAT.)
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V. Pasos
:
El uso exitoso del sistema de secuenciación Silver Stain requiere una cuidadosa consideración de los pasos proporcionados. La tinción con plata es menos sensible que la detección radiactiva, requiere una mayor cantidad de plantilla y no puede aumentar la intensidad de la señal extendiendo el tiempo de exposición de la película de rayos X. Por lo tanto, utilice la cantidad recomendada de plantilla de ADN, verifique la confiabilidad del sistema utilizando el control proporcionado cada vez y preste atención a los siguientes puntos:
(1) La concentración y pureza del ADN deben determinarse mediante electroforesis en gel de agarosa o ensayo de fluorescencia, la muestra debe someterse a electroforesis con una cantidad conocida de ADN.
(2) La espectrofotometría no puede estimar de manera confiable la concentración de ADN de muchos extractos de ADN (incluidas pequeñas preparaciones de plásmidos), y el ADN cromosómico mixto, las proteínas, el ARN y los compuestos orgánicos e inorgánicos pueden tener una absorción de luz de 260 nm. Por lo tanto, la espectrofotometría a menudo sobreestima incorrectamente la concentración de ADN.
(3) Los ribonucleótidos producidos por el tratamiento con ribonucleasa durante el proceso de preparación del ADN seguirán absorbiendo luz a 260 nm aunque estén delante de la muestra de ADN y no se puedan observar después de la electroforesis.
(1) Reacción de secuenciación:
1. Etiquete cuatro tubos Epedov de 0,5 ml (G, A, T, C) para cada conjunto de reacciones de secuenciación. Agregue 2 ml de la mezcla d/ddNTP adecuada (mezcla d/ddNTP) a cada tubo. Agregue 1 gota (aproximadamente 20 ml) de aceite mineral a cada tubo, tápelo y guárdelo en hielo o a 4°C para su uso posterior.
2. Para cada conjunto de cuatro reacciones de secuenciación, mezcle los siguientes reactivos en un tubo eppendorf:
(1) Reacción de muestra:
Plantilla de plásmido ADN 2.1 pmol
Tampón de secuenciación 5× 5 ml
Cebador 4,5 pmol
ddH2O estéril hasta volumen final 16 ml
(2) Reacción de control
pGEM-3Zf( ) ADN de control (4 mg) 4,0 ml
Tampón de secuenciación 5X 5 ml
Cebador directo pUC/M13 (4,5 pmol) 3,6 ml
ddH2 O estéril hasta un volumen final de 16 ml
3. Agregue 1,0 ml de ADN polimerasa Taq de grado de secuenciación a la mezcla de cebador/plantilla (paso 2 anterior) (5 u/ml). . Revuelva varias veces con una pipeta.
4. Utilice una pipeta para transferir 4 ml de la mezcla de enzima/cebador/plantilla en el paso 3 a un tubo de mezcla de d/ddNTP.
5. Centrifugar en una microcentrífuga hasta que toda la solución esté en el fondo del tubo eppendorf.
6. Coloque el tubo de reacción en un termociclador precalentado a 95 °C e inicie el programa de ciclo utilizando el modo de ciclo en [Nota] como referencia. Se debe elegir la temperatura de recocido óptima para cada combinación de imprimador/plantilla. El siguiente programa normalmente lee una longitud de 350 bases desde el inicio del cebador.
7. Una vez completado el programa del ciclo térmico, agregue 3 μl de solución de parada de secuenciación de ADN a cada tubo y gire suavemente en una microcentrífuga para detener la reacción.
[Nota] 1. La cantidad de ADN plantilla utilizada para la secuenciación es generalmente la siguiente:
Tipo/longitud de plantilla Cantidad de plantilla
200 pb (producto de PCR) 16 ng (120 fmol)
3000-5000 pb (ADN plasmídico superenrollado) 4 mg (2 pmol)
48000 pb (λ, 1 mg (31 fmol)
Señal debida al plásmido superenrollado Más débil que el ADN bicatenario lineal relajado, por lo que la cantidad de plásmido superenrollado utilizado como plantilla es mayor que la de otras plantillas.
2. La siguiente fórmula general se puede utilizar para calcular el número de nanogramos de cebador equivalentes a 4,5 pmol:
4,5 pmol=1,5 ng×n, donde n es el número de bases de cebador
La siguiente fórmula general se puede utilizar para calcular el número de microgramos de cebador equivalentes a 1 pmol:
ADNbc: 1 pmol=(6,6×10-4 mg)×n , donde n es el número de pares de bases plantilla
ssDNA: 1pmol=(3.3×10-4 mg)×n, donde n es el número de bases plantilla
3. evitar que la ADN polimerasa Taq extienda el cebador de hibridación no específico, calentar El ciclador debe precalentarse a 95 °C. Los cambios de temperatura deben ser lo más rápidos posible. Los siguientes tiempos de ciclo no incluyen el tiempo de cambio de temperatura. Si no está seguro de qué modo utilizar, se recomienda comenzar con el Modo 1.
Modo 1: Para uso con primer lt;24 bases o contenido de GC lt;50
95°C durante 2 minutos. Luego: 95°C durante 30 segundos (desnaturalización), 42°C durante 30 segundos (recocido), 70°C durante 1 minuto (extensión).
Modo 2: Para cebadores ≥24 bases o ligeramente más cortos con GC≥50.
95°C durante 2 minutos, luego: 95°C durante 30 segundos (desnaturalización), 70°C durante 30 segundos (recocido/extensión). 4.4 Después de agregar la solución de parada, la muestra se puede almacenar a 4°C durante la noche.
(2) Preparación de placas de gel de secuenciación
1. Manipulación de placas de vidrio:
Las placas de vidrio para secuenciación teñidas de plata deben estar muy limpias, y generalmente se usan primero Lavar con agua tibia y detergente, luego enjuagar con agua desionizada para eliminar el detergente residual y finalmente limpiar la placa de vidrio con etanol. Las micropelículas de detergente que quedan en las placas de vidrio pueden provocar un fondo alto (marrón) al teñir los geles. Trate una placa de vidrio corta con una solución aglutinante para reticular químicamente el gel con la placa de vidrio. Este paso es fundamental para evitar que el gel se rompa durante los procedimientos de tinción con plata.
(1) Tratamiento de placas de vidrio cortas
A. Añadir 5 ml de Bind Silane a 1 ml de etanol 95 y ácido acético glacial 0,5 para preparar un nuevo líquido aglutinante.
B. Utilice un pañuelo de papel absorbente humedecido en la solución adhesiva recién preparada para limpiar la placa de vidrio que se ha limpiado cuidadosamente y secado de forma natural. Se debe limpiar toda la superficie de la placa.
C. Después de 4-5 minutos, limpie la placa de vidrio con etanol al 95% en una dirección y luego límpiela en dirección vertical con un poco de fuerza. Repita este proceso de limpieza tres veces, limpiando el exceso de adhesivo con un papel limpio cada vez.
[Nota] 1. Al limpiar la placa de vidrio en una dirección con etanol al 95%, si usa demasiada fuerza, se quitará demasiado adhesivo de silano, lo que provocará que el gel no se adhiera bien.
2. Cámbiate los guantes antes de preparar la placa de vidrio larga para evitar que se adhiera el silano adhesivo.
3. Asegúrese de evitar que la solución adhesiva contamine la placa de vidrio larga, de lo contrario provocará que el gel se rompa.
(2) Tratamiento de placas de vidrio largas
A. Limpie la placa de vidrio larga limpia con un pañuelo de papel humedecido en solución de Sigmacote.
B. Limpie la placa de vidrio con un paño absorbente después de 5-10 minutos para eliminar el exceso de solución de Sigmacote.
[Nota] 1. El gel usado se puede remojar en agua y luego raspar con una cuchilla o un raspador de plástico. Los paneles de vidrio deben limpiarse completamente con un quitamanchas. Alternativamente, el gel se puede eliminar sumergiéndolo en una solución de NaOH al 10%. Para evitar la contaminación cruzada, las herramientas para limpiar placas de vidrio cortas deben separarse de las herramientas para limpiar placas de vidrio largas. Si se produce contaminación cruzada, los geles preparados posteriormente pueden romperse o soltarse;
2. Preparación del gel:
(1) Después de tratar la placa de vidrio con gel de sílice adhesivo y Sigmacote, se puede fijar la placa de vidrio.
El método consiste en utilizar tiras de borde de 0,2 mm o 0,4 mm de espesor en los lados izquierdo y derecho de la placa de vidrio y luego presionar una placa de vidrio encima. Inserta el borde plano de un peine con dientes de tiburón en un lado de la placa de vidrio larga y asegúralo con un clip.
(2) Según la concentración de gel requerida, prepare el gel de secuenciación de acuerdo con la siguiente tabla. Generalmente, una concentración de gel de 6-8 puede lograr mejores resultados. Durante el proceso de preparación, primero use una cantidad adecuada de agua bidestilada para disolver la urea, luego agregue Acramp Bis y tampón TBE 10x, luego use agua bidestilada para ajustar el volumen final a 99,2 ml, filtre con un filtro de 0,45 mm. filtrar la membrana, y luego agregar ácido persulfúrico AMONIO Y TEMED. No es necesario calentar la solución al disolver la urea. Si es necesario calentar, deje que la solución se enfríe por completo antes de agregar TEMED y persulfato de amonio. Generalmente, la polimerización comienza entre 4 y 6 minutos después de la inyección. Si la polimerización no es buena, se deben utilizar altas concentraciones de TEMED y persulfato de amonio. 0
Agua bidestilada (ml) 47,5 45,0 43,0 40,5 35,0 25,0 15,0 5,0
10 persulfato de amonio (ml) 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 80 70 47 40
(3) Una vez preparado el gel, se puede cargar en la placa de gel. Generalmente, el gel se vierte lentamente en la ranura de la placa de vidrio a lo largo del borde de la tira de presión y luego se deja reposar para que se complete la polimerización.
[Notas] 1. Cuando utilice una abrazadera para fijar la placa de vidrio, es mejor hacer la abrazadera un poco más fuerte para evitar que una fuerza insuficiente provoque fugas de pegamento durante el proceso de llenado de gel.
2. Tenga cuidado de no generar burbujas al llenar el gel, de lo contrario afectará los resultados de la secuenciación.
(3) Electroforesis:
1. Pre-electroforesis
(1) Una vez completada la polimerización del gel, deje a un lado el peine de dientes de tiburón e invierta el peine. El extremo del diente se inserta en el gel para formar un orificio de muestra.
(2) Fije inmediatamente la placa de gel en el tanque de gel de secuenciación. Generalmente, los tanques superior e inferior del tanque de gel de secuenciación están separados, por lo que el tampón TBE solo se puede agregar después de fijar la placa de gel.
(3) Diluya el tampón 10×TBE en 1×TBE, agréguelo a los tanques de electroforesis superior e inferior, elimine las burbujas generadas, encienda la alimentación y prepárese para la preelectroforesis.
(4) Algunos tanques de electroforesis, como el Macrophor de LKB, utilizan calentamiento por baño de agua, por lo que el baño de agua debe calentarse a 55 °C antes de la electroforesis. Algunos no utilizan calentamiento por baño de agua y dependen de su propia disipación de calor durante el proceso de electroforesis, como el tanque de electroforesis de secuenciación producido por Shanghai Qiujing Plexiglas Instruments. Este tanque debe intercalarse con dos placas de aluminio disipadoras de calor para lograr la temperatura. toda la placa de gel es consistente.
(5) Preelectroforesis, 30V/cm, 20-30 minutos. El proceso de preelectroforesis consiste en eliminar los iones de impureza del gel y al mismo tiempo permitir que la placa de gel alcance la temperatura requerida. La electroforesis a alta temperatura previene la formación de estructuras en forma de horquilla en regiones ricas en GC, lo que puede afectar los resultados de la secuenciación.
[Nota]
(1). Cuando utilice un peine de dientes de tiburón para hacer bien la muestra, tenga cuidado de insertar la punta del diente en el gel aproximadamente 0,5 mm, y tenga cuidado de no permitir que la muestra que se va a agregar tenga fugas, de lo contrario no se obtendrán resultados correctos.
(2). Siempre preste atención a si el tampón del tanque de electroforesis tiene fugas; de lo contrario, fácilmente provocará un cortocircuito y dañará el instrumento de electroforesis.
2. Preparación de la muestra:
Durante la preelectroforesis, se puede llevar a cabo la preparación de la muestra. Coloque la muestra reaccionada en un baño de agua hirviendo y caliéntela durante 1-3 minutos. luego póngalo inmediatamente en hielo. Si la muestra no se utiliza durante un largo tiempo, se debe reprocesar. Se pueden utilizar de 4 a 6 geles de poliacrilamida con un espesor de 0,4 mm; los geles con un espesor superior a 0,4 mm pueden generar señales demasiado débiles. No es necesario quitar la capa superior de aceite mineral al agregar la muestra, pero se debe aspirar con cuidado la muestra azul debajo del aceite mineral.
3. Muestreo y electroforesis
Apague el instrumento de electroforesis, use una pipeta para extraer el tampón para limpiar bien la muestra, elimine la urea que se difundió durante la preelectroforesis y luego inmediatamente sáquelo con una muestra de muestra capilar y agréguelo al pocillo de muestra. El orden de adición de muestras es generalmente G, A, T, C. Se puede utilizar un voltaje de 30 V/cm al comienzo de la electroforesis, que puede aumentarse a 40-60 V/cm después de 5 minutos y mantenerse a un voltaje constante. En términos generales, una placa de gel de 55 cm de largo y 0,2 mm de espesor se puede someter a electroforesis hasta el fondo en 2 horas a un voltaje constante de 2500 V. Al mismo tiempo, durante el proceso de electroforesis, la corriente se puede reducir constantemente de 28 mA a 25 mA. Para leer secuencias más largas, se pueden utilizar dos o más rondas en la muestra.
[Notas]
1. Al cargar muestras para electroforesis, asegúrese de prestar atención a que la temperatura de la placa de gel alcance aproximadamente 55 °C si aún no la ha alcanzado. , espere hasta que la temperatura alcance los 55 °C. Cargue la muestra para la electroforesis.
2. En términos generales, el voltaje durante la electroforesis no debe ser demasiado alto, porque un voltaje demasiado alto reducirá la resolución del gel y hará que las bandas se difundan. Durante la electroforesis se puede realizar una electroforesis de potencia constante.
(4) Tinción con plata de geles de secuenciación
El proceso de tinción requiere sumergir el gel en un recipiente de plástico. Por lo tanto, utilice al menos dos discos de tamaño similar a las placas de vidrio. El plato debe limpiarse con agua de buena calidad antes de agregarle una solución nueva.
1. Una vez completada la electroforesis, separe cuidadosamente las dos placas con un paño plástico y el gel debe quedar firmemente pegado a la placa de vidrio corta.
2. Fijar el gel: Coloque el gel (junto con la placa de vidrio) en un recipiente de plástico, sumérjalo en la solución fijadora/parada y agite bien durante 20 minutos o hasta que el tinte se absorba por completo en la muestra. desaparece; el gel se puede dejar en la solución fijadora/de parada durante la noche (no es necesario agitarlo). Reserve la solución fijadora/de parada para detener la reacción de revelado.
3. Lavar el gel: Enjuagar el gel 3 veces con agua ultrapura durante 2 minutos cada vez y agitar. Retirar del agua y al transferir a la siguiente solución, sostener el borde del plato durante 10 a 20 segundos para permitir que se escurra el agua.
4. Tinción en gel: Transfiera el gel a la solución de tinción y agite bien durante 30 minutos.
5. Revelado en gel:
(1). Añadir formaldehído (3 ml) y solución de tiosulfato de sodio (400 μl) al revelador para completar la preparación del revelador.
(2). Saca el gel de la solución colorante, colócalo en un recipiente lleno de agua ultrapura y déjalo en remojo durante 5 a 10 segundos. Tenga en cuenta que el tiempo total para transferir el gel del agua ultrapura al revelador no debe exceder de 5 a 10 segundos. Remojarlo durante demasiado tiempo hará que la señal se debilite o desaparezca. Si el tiempo de remojo es demasiado largo, repita el paso 5 con la solución colorante.
(3).Transfiera inmediatamente el gel a 1 litro (la mitad del volumen total) de desarrollador preenfriado y agite bien hasta que comience a aparecer la banda de la plantilla o comience a aparecer la primera banda. Aplique el gel al litro restante de revelador y continúe revelando durante 2-3 minutos, o hasta que aparezcan todas las bandas.
6. Fija el gel: Añade un volumen igual de fijador/solución fijadora directamente al revelador. Detenga la reacción de desarrollo y fije el gel.
7. Enjuague el gel dos veces con agua ultrapura durante 2 minutos cada vez. Durante este proceso, asegúrese de usar guantes y sujetar el borde de la placa de desarrollo para evitar dejar huellas dactilares en el gel.
8. Secar el gel a temperatura ambiente o mediante calor de extracción. Observe el gel en una caja de luz visible o sobre un fondo blanco o amarillo brillante (como papel) y guarde los resultados en una película EDF si se requieren registros permanentes.
[Nota] La tinción con plata de productos de secuenciación es un nuevo método para visualizar información de secuencia. El éxito de este sistema se ve afectado por varios factores.
1. La calidad del agua es extremadamente importante para el éxito del teñido. El agua ultrapura (agua de NANOpureR o Milli-QR) o agua bidestilada funciona mejor; si hay impurezas en el agua, es posible que no aparezcan bandas de bajo peso molecular.
2. El carbonato de sodio también es muy importante.
Es mejor utilizar carbonato de sodio fresco de grado de la American Chemical Society, como carbonato de sodio de grado reactivo Fisher y Kodak ACS (Fisher Cat #S263-500 o S262-3, o Kodak Cat #109-1990), que generalmente da mejores resultados.
3. El paso de lavado después del teñido es crucial. Si el gel se lava durante demasiado tiempo, las partículas de plata se desprenderán del ADN, produciendo poca o ninguna señal de secuencia. Si el lavado tarda demasiado, repite el paso de teñido.
4. Si el espesor del gel es superior a 0,4 mm, o la concentración de acrilamida es superior a 4-6, es necesario ampliar el tiempo de fijación y tinción. Si el espesor del gel es inferior a 0,4 mm, el tiempo de lavado después de la reacción de tinción debe acortarse a no más de 5 segundos.
5. Excepto la reacción de desarrollo, todos los pasos se realizan a temperatura ambiente. La solución de revelado debe enfriarse previamente a 10-12 °C para reducir la decoloración de fondo. Nota: Agregue formaldehído y tiosulfato de sodio al revelador antes de usarlo. Utilice soluciones de tinción y revelado recién preparadas. No reutilice ninguna solución.