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Solución:

(1) Tampón de transferencia: pesar 2,9 g de glicina y Tris base 5,8 g, SDS 0,37, metanol 200 ml, agregue agua desionizada a 1000 ml. Si el peso molecular de la proteína es pequeño, no es necesario agregar SDS.

(2) PBS-T: NaCl 8,0 g. , KCl 0,2 g, KH2PO4 0,2 g, Na2HPO4?12H2O 2,9 g, disolver en 800 ml de agua desionizada, ajustar el valor de pH a 7,4 con ácido clorhídrico, ajustar el volumen a 1000 ml y agregar Tween20 al 0,05 %.

(3) Solución selladora: 5% de leche desnatada disuelta en PBS

(4) Solución de tinte negro amino: 0,2% de negro amino disuelto en ácido acético al 7%.

(5) Solución de decoloración de amino negro: 30% de metanol, 10% de solución de ácido acético glacial

Soluciones relacionadas con SDS-PAGE

(1). :

Tris: 6 g

Glicina: 28,8 g

(10%) SDS: 10 ml

Añadir 1000 ml H2O PH : 8,3

(2). Tampón de separación: 100 ml:

Tris: 36,6 g

HCL 1N: (48 ml): PH: 8,9

p>

Añadir agua a: 100ml

(3). Tampón de concentración de gel: 100 ml:

Tres: 5,98 Gramos

HCL 1N: ( aproximadamente 48 ml): PH:

Añadir agua a: 100 ml

(4) Solución de almacenamiento de gel: 100ml:

Acr:30g

Bis:0,8g

Añadir agua a: 100ml

: 100ml

(5 ).4X tampón de carga:

2-Me: 20% 2ml

SDS: 8% 0,8g

Glicerol: 40% 4ml

Azul de bromofenol: 0,4% 0,04g

Tris-CL (ph6.8) 240mM 2.5ml (tampón gel concentrado)

Añadir 1.5ml H2O

Total: 10ml

(6 ) Solución colorante (fórmula de teñido rápido, teñido durante 1 hora

0,1% azul Coomassie, 10% ácido acético, 45% metanol

Azul Cumasi R-250 1g

Metanol 450ml

Agua 450ml

Ácido acético glacial 100ml

(7 ).Solución decolorante: 1000 ml

Glacial ácido acético: 75 ml

Metanol: 50 ml

Agua: 875 ml

Solución de lisis celular

(1) Tampón A: Tris 25 mM pH 7,5

KCl 50 mM

MgCl2 2 mM

EDTA 1 mM

EDTA 1 mM.p> EDTA 1 mM

Ditiotreitol (DTT) 5 mM

(2) Solución de lisis del núcleo

Tampón NE:

25 mM Tris pH 7,5

NaCl 0,42 M

MgCl2 1,5 mM

EDTA 0,5 mM

Ditiotreitol (DTT) 1 mM

25% de sacarosa

0,2% SDS (no añadido durante la inmunoprecipitación)

Añadir inhibidores de proteasa antes de lisar las células, con una concentración final de 100 mg/L-1 PMSF , 1 mg/L-1 de Aprotinina y 2 mg?L-1 de Leupeptina

Paso: Electroforesis SDS-PAGE

Preparar geles de diferentes concentraciones según el método de configuración del gel. el tinte al fondo del gel de separación durante la electroforesis y apague la alimentación. Saque el gel,

Western Blot

1. Después de la electroforesis, corte el gel que se transferirá al carril de proteínas y marque la esquina inferior derecha para determinar la dirección y el frente. y de vuelta.

2. Corta un trozo de membrana NC del mismo tamaño que el gel (no más grande que el gel), marca la esquina inferior derecha y sumérgelo en el tampón de transferencia durante unos 5 minutos.

3. Corte 8 trozos de papel de filtro Xinhua No. 1, marque la esquina inferior derecha y haga que el tamaño sea aproximadamente el mismo que el del gel (no más grande que el gel).

4. Remoje el papel de filtro cortado en el tampón de transferencia e instale el dispositivo de transferencia en el orden del ánodo al cátodo (de abajo hacia arriba): coloque el electrodo inferior plano y coloque los 4 empapados. papel de filtro en el electrodo inferior y alinearlo con precisión. Coloque la membrana NC sobre el papel de filtro para eliminar las burbujas de aire. Transfiera el gel de electroforesis SDS-PAGE para transferir el tampón y enjuague bien, colóquelo sobre la membrana NC y exprima las burbujas de aire con una varilla de vidrio. Coloque 4 hojas más de papel de filtro empapado encima para expulsar las burbujas de aire.

5. Coloque el electrodo superior en la capa intermedia, conecte la fuente de alimentación, encienda la alimentación a 1 mA/cm2 según el área del gel y electropore el gel durante 2 ~ 4 h.

6. Después de la transferencia, retire el papel de filtro. Transfiera el gel a un plato teñido de Thomas Brilliant Blue y verifique que la transferencia de proteínas esté completa. Corte la membrana NC que contiene el estándar de peso molecular, colóquela en una solución de tinción de negro amino para teñir durante 30 segundos y luego colóquela en una solución de tinción de negro amino para decolorar.

7. Enjuague la membrana NC sobre la que se ha transferido la proteína con agua destilada, séquela ligeramente y luego sumérjala en la solución selladora a 4°C durante la noche. Luego lave la membrana tres veces con PBS. -T buffer durante 10 minutos cada vez. Después de incubar la membrana con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 2 horas, diluya el anticuerpo primario con tampón PBS-T en diferentes proporciones de dilución para encontrar la concentración de anticuerpo primario más adecuada. Luego lave la membrana 3 veces con tampón PBS-T y. luego lavar con PBS Lavar la membrana 3 veces con tampón -T, 10 minutos cada vez. Lave la membrana tres veces con tampón PBS-T durante 10 minutos cada vez.

9. Incubar con IgG anti-ratón de cabra marcada con HRP (1:5000)**** durante 1 hora, luego lavar la membrana 3 veces con tampón PBS-T, 10 minutos cada vez.

10. Preparar el sustrato luminiscente (mezclar la solución de sustrato 1:1).

11. Enjuague el sustrato quimioluminiscente en tampón PBS-T durante 2 minutos para desarrollar el color, y observe y tome fotografías con el sistema de imágenes en gel. (O use una solución cromogénica DAB para desarrollar el color bajo la luz durante aproximadamente 15 minutos y enjuague con agua inmediatamente después de que la banda parezca interrumpir la reacción del color).

Solo te estoy dando un ejemplo, porque sólo los experimentos que tú mismo hagas serán útiles. Si alguien más te enseña a hacer un experimento, entonces tu pensamiento seguirá a los demás y es posible que otros te engañen. Entonces, ¿cuál es el punto de hacer este experimento?