Cómo diseñar cebadores para PCR en tiempo real
Con base en información encontrada en línea y los requisitos de diseño de cebadores en las instrucciones de TaKaRa, así como discusiones en la literatura, resumimos los requisitos y los pasos de diseño para el diseño de cebadores de PCR en tiempo real. En primer lugar, quiero agradecer a cualquiera que haya publicado antes. Porque parte del contenido es una cita suya
1. Los cebadores deben diseñarse dentro de la región conservada de la serie de ácidos nucleicos y ser específicos. Está mejor ubicado dentro de la región de 300-400 pb en el extremo 5' de la región de codificación. Puede utilizar el software DNAman y Alignment para ver los resultados.
2. La longitud de los cebadores generalmente está entre 17 y 25 bases, y la diferencia entre los cebadores ascendentes y descendentes no debe ser demasiado grande.
3. El contenido de G C está entre 40 y 60, siendo 45-55 el mejor.
4. Requisitos de la secuencia del cebador: la distribución general de A, T, C y G debe ser lo más uniforme posible, y algunas partes no deben ser ricas en AT ni en GC (especialmente 3′). Y evite la estructura continua T/C (polipirimidina) o A/G (polipurina).
5. Evite más de 3 bases de secuencias complementarias dentro de un cebador o entre dos cebadores, y evite más de 2 secuencias complementarias en el 3' entre dos cebadores.
6. Especificidad: Confirmar la especificidad de los cebadores mediante búsqueda BLAST.
7. El extremo 5′ del cebador se puede modificar.
8. Los valores de TM de los dos cebadores no pueden diferir demasiado. Se debe utilizar una manguera especial para calcular el valor de TM: OLIGO: 63-68 grados Primer3: 60-65 grados. p>
9. Es mejor que el extremo 3' del cebador sea G o C, y se debe evitar que el extremo 3' sea T.
10. El diseño general de los cebadores debe eliminar la distribución de que el extremo 5' del cebador es más grande que el extremo 3' y la energía libre del extremo 3' debe ser inferior a 9 KJ. /mol. Podemos utilizar el software oligo 6 para comparar los resultados.
11. La longitud del producto utilizado para la cuantificación de la fluorescencia debe ser de 80-150 pb, y la longitud máxima debe ser de 300 pb.
12. Los cebadores deben diseñarse para evitar la contaminación del ADN, y es mejor que los cebadores abarquen la región de unión del exón.
13. La homología entre el cebador y la secuencia de amplificación no específica es preferentemente inferior a 70, o tiene 8 bases complementarias homólogas.
14. Comprobar la presencia de pseudogenes. Los pseudogenes son secuencias de ADN no funcionales que tienen una longitud similar al fragmento diana que se va a amplificar.
Nuestra experiencia es utilizar el software de diseño de cebadores Primer 5.0 para diseñar cebadores de acuerdo con los requisitos anteriores. Por supuesto, es imposible que cada cebador cumpla con los requisitos anteriores (cuando construimos algunos vectores, los cumplimos). ¿No es necesario agregar enzimas antes de la secuencia codificante? ¿Sitios de corte y bases protectoras? Si desea utilizar cebadores, puede elegir mejores cebadores. Que funcione o no depende de tu suerte.