¿Cómo obtienen los microbios el ATP que necesitan?
"Prueba rápida de fluorescencia: la aplicación de biosensores no es un sueño. Entrevista con el profesor Jin Zhenhua, director técnico de Shenyang Zhongke Liangma Bioengineering Co., Ltd."
p>El método de fluorescencia de ATP se desarrolló basándose en el principio de luminiscencia de luciérnaga. El método de fluorescencia ATP se desarrolló basándose en el principio de luminiscencia de luciérnaga. La razón por la que las luciérnagas pueden emitir luz es porque pueden sintetizar biocatalizadores que convierten la energía química de las sustancias químicas en energía luminosa: luciferasa de luciérnaga (conocida como luciferasa de insectos, luciferasa), luciferina de insectos (D-luciferina) y ATP (trifosfato de adenosina). una sustancia energética producida por todos los organismos celulares). En condiciones aeróbicas, la luciferasa cataliza la luciferina para producir luciferina oxidada, que emite fluorescencia. Si se cumplen las condiciones anteriores, incluso el sistema fuera del cuerpo de la luciérnaga puede emitir fluorescencia. Ya a finales de la década de 1950, la NASA utilizó la luciferasa de luciérnaga para establecer una tecnología rápida de detección de ATP de ultratraza. A finales de la década de 1960, realizó la detección de ATP en muestras de suelo terrestre y luego la utilizó en la Luna. Detección de la existencia de vida en Marte. La aplicación comercial de la tecnología de detección de ATP basada en la luciferasa de gusano comenzó a finales de los años 1980. Inicialmente, esta enzima se obtuvo cultivando larvas de luciérnaga. Con el desarrollo y aplicación de la tecnología de ingeniería genética, los científicos eliminaron el gen que codifica la enzima de luciérnaga de las células de luciérnaga y lo introdujeron en células bacterianas. De esta forma, mediante fermentación biológica se puede obtener una gran cantidad de fototransferasa de insectos en apenas una decena de horas.
En 2003, Shenyang Zhongke Liangma presentó el proyecto patentado "Nuevas cepas que contienen genes de luciferasa y producción de luciferasa de insectos", inventado por el profesor Jin Zhenhua del Instituto de Investigación para el Desarrollo de la Academia China de Ciencias. desarrollo industrial Exploración química y finalmente comenzó la producción en masa de luciferasa de insectos y luciferasa de insectos con derechos de propiedad intelectual independientes después de 2005. Después de varios años de exploración de la industrialización, finalmente comenzamos la producción en masa de enzimas y luciferinas con derechos de propiedad intelectual independientes después de 2005. En 2007, completamos la combinación de productos de detección relacionados y logramos una detección rápida del número total de bacterias en muestras de alimentos. El principio de detección de fluorescencia de ATP se basa en el hecho de que la luciferasa catalizará la reacción de luciferina y producirá fluorescencia sólo en presencia de ATP. Por tanto, si hay un exceso de fotonasa y luciferina, la intensidad de la fluorescencia sólo dependerá de la cantidad de ATP en el sistema de reacción. Tomando como ejemplo la detección de bacterias en una muestra, cuanto mayor es el número de células, mayor es el contenido de ATP y más fuerte es la fluorescencia emitida. En otras palabras, bajo ciertas condiciones, el valor de fluorescencia está relacionado linealmente con la cantidad de ATP; además, el valor de fluorescencia se puede medir de manera fácil y precisa con un fotómetro. Por lo tanto, en el caso de excluir la interferencia del ATP no bacteriano en la muestra, siempre que se obtenga la curva de relación entre el valor de fluorescencia relativa y el número de células bacterianas, y luego con base en la curva estándar del valor de fluorescencia relativa de ATP puro y el número de células, se puede determinar rápidamente el número de células bacterianas en la muestra.
La composición y función del sistema de detección rápida de ATP Actualmente, existen muchos sistemas de aplicación para la detección de biomasa, enzimas y metabolitos basados en el principio de luminiscencia de luciérnaga. Aunque los propósitos de la aplicación, los métodos operativos y las fuentes de muestra de varios sistemas de detección son diferentes, su composición no es más que las siguientes partes.
1. Sistema de reactivos El sistema de reactivos incluye todos los reactivos de reacción necesarios para provocar reacciones de fluorescencia y reactivos de extracción eficaces de ATP. Específicamente, incluye un juego de reactivos para lisis de células somáticas, un juego de reactivos para lisis de células bacterianas y un juego de reactivos para reacción de fluorescencia. El conjunto de reactivos para lisis de células somáticas puede lisar de manera específica y eficiente células no bacterianas (células somáticas) en la muestra y liberar ATP del ATP, que luego se filtra a través del filtro en el fondo de la cubeta. El objetivo principal del kit de lisis de células bacterianas es lisar eficazmente las células bacterianas y liberar ATP para su detección. Al mismo tiempo, para evitar que la degradación del ATP afecte la autenticidad de los resultados de la prueba, los reactivos de lisis de células bacterianas deberían poder inactivar rápidamente las enzimas que degradan el ATP. El kit de reacción de fluorescencia incluye luciferina de gusano y luciferasa de gusano, que reaccionan con el ATP bacteriano en la muestra y emiten fluorescencia.
2. Dispositivo de preprocesamiento de muestras y muestras. Esta parte del muestreador puede obtener muestras cuantitativas para analizarlas en diferentes estados físicos. Es un presurizador para la descarga de ATP de células somáticas y una copa colorimétrica de membrana. reactores para reacciones en copa y concentradores para concentración de muestras.
3. Microfotómetro El microfotómetro es un instrumento de detección de microfluorescencia. Dependiendo de las necesidades específicas, además de una pantalla que mide y muestra valores de fluorescencia, el fotómetro también se puede conectar a una interfaz externa de una computadora personal o una impresora automática para registrar y almacenar datos relevantes para la calidad del producto o el análisis de tendencias de monitoreo de la salud.
Ventajas de la tecnología de detección rápida de ATP En términos generales, lograr una detección rápida depende de si la muestra a analizar puede producir señales sonoras, luminosas y magnéticas fáciles de detectar durante el proceso de reacción. La detección rápida de la fluorescencia del ATP se logra porque puede producir una fluorescencia que es fácil de detectar. En términos de seguimiento de la salud, tiene ventajas que las pruebas convencionales no pueden igualar. Tanto la práctica como la literatura muestran que el valor de fluorescencia detectado por el sistema de detección rápida, es decir, el valor total de ATP (refiriéndose al ATP tanto de las bacterias como de los residuos), se utiliza como indicador de control de la higiene, tanto en términos de "puntualidad" como de El efecto real se contaron mediante inspección visual o mediante recuento en placa. Por tanto, existe la opinión de que la cantidad total de ATP puede utilizarse como criterio para juzgar la calidad de la higiene.
1. El método de recuento de placas de Petri convencional, rápido y preciso, consiste en detectar el número total de bacterias, que consiste en cultivar bacterias en medio LB en colonias bacterianas visibles a simple vista. Debido a la dilución desigual de la muestra y otras razones, una colonia suele estar compuesta por dos o más células bacterianas y el medio LB solo es adecuado para el crecimiento de bacterias aeróbicas o semiaeróbicas. Por tanto, sólo se pueden obtener los números de este tipo de bacterias. Todas las bacterias, hongos y algas se pueden detectar utilizando el método de detección rápida por fluorescencia ATP, que proporciona resultados en tiempo real en 1 a 5 minutos, es fácil de operar y lleva poco tiempo. El método de recuento en placa de Petri tarda entre 1 y 5 días y los resultados no reflejan las condiciones de higiene reales.
2. La cantidad de muestra es pequeña, porque la enzima es muy sensible a la reacción de ATP, y se pueden detectar menos de 0,1 pg de moléculas (10-12 mol) de ATP a través de la reacción de luminiscencia, por lo que Se puede utilizar para detectar muestras con bajo contenido bacteriano. Por ejemplo, el contenido bacteriano de la cerveza filtrada y esterilizada mediante una membrana de 0,45 µm es muy bajo y no puede detectarse mediante métodos convencionales, pero puede detectarse mediante el proceso de concentración del método de fluorescencia de ATP. La aplicación del "sistema de detección rápida del método de fluorescencia de ATP para el recuento bacteriano total" en el seguimiento de todo el proceso utilizando la tecnología de detección rápida de ATP comenzó en la década de 1990. Desde la década de 1990, se han desarrollado y comercializado con éxito una variedad de productos basados en el principio de luminiscencia de las luciérnagas. Por ejemplo, el "Sistema de detección rápida total de bacterias fluorescentes ATP" desarrollado por Zhongke Liangma se puede utilizar para monitorear todo el proceso de procesamiento de alimentos, bebidas y productos lácteos: antes de la producción y el procesamiento, se puede utilizar para detectar la limpieza y desinfección. Efectos de las instalaciones de producción. Detección del recuento bacteriano total en materiales. Durante el proceso de producción, se puede utilizar para el monitoreo higiénico de puntos de control clave de los equipos de producción (como el suministro de agua, válvulas de ventilación) y la detección del número total de microorganismos especiales que afectan las bebidas lácteas fermentadas y el alcohol después del procesamiento. se puede utilizar para bacterias en productos terminados contaminados Número total de pruebas. Además, también se puede utilizar para la detección rápida de microorganismos (número total de bacterias) en diversas muestras por parte de organismos encargados de hacer cumplir la ley, como protección ambiental, asuntos hídricos, aduanas y cuarentena. A través de investigaciones en líneas de producción de alimentos o entornos sanitarios circundantes, se encontró que cuando se utiliza el método de detección rápida de ATP en HACCP, si el número total de bacterias en un determinado punto de la línea de producción obtenida por el método de conteo en placa es muy pequeño o estéril, mientras que el número total de bacterias obtenidas mediante el método de detección de fluorescencia de ATP es muy pequeño o estéril. Si el valor de ATP es muy alto, entonces el punto de detección es propenso a una gran cantidad de microorganismos. El análisis mostró que el valor total de ATP obtenido mediante el ensayo de fluorescencia de ATP se derivó tanto de residuos como de microorganismos. En la mayoría de los casos, los microorganismos representan una proporción menor. Por lo tanto, se puede juzgar si el punto de detección volverá a contaminarse mediante el valor de ATP de la detección de fluorescencia de ATP, en lugar de juzgar el número total de colonias bacterianas en función del valor de ATP de las células bacterianas. Sin embargo, la clave es determinar el ATP. Valores críticos de diferentes puntos de detección en diferentes líneas de producción. Por lo tanto, los países desarrollados han aplicado la detección de fluorescencia de ATP al HACCP para evaluar si las materias primas alimentarias y las superficies en contacto con las materias primas alimentarias cumplen con los estándares higiénicos después de la limpieza y desinfección, y luego implementar un monitoreo clave de las partes clave susceptibles a la contaminación microbiana.
Por ejemplo, mediante las pruebas rápidas de ATP, se puede determinar si es probable que las piezas o superficies que hayan alcanzado los estándares higiénicos estén contaminadas durante el intervalo entre la desinfección de rutina y la nueva ronda de producción. Luego, se puede formular un plan que sea coherente con ellos. la situación de la unidad y los requisitos higiénicos. Aplicación del probador rápido de ATP tipo palma En la actualidad, el probador rápido de ATP tipo palma se ha utilizado en todos los aspectos de la vida. Su aplicación en alimentos es principalmente para detectar el estado higiénico de la vajilla en restaurantes y trenes. El Ministerio de Ferrocarriles de China ha decidido que antes de los Juegos Olímpicos de 2008, se utilizará en los trenes un detector rápido de tipo palma producido por Shenyang Zhongke Liangma Bioengineering Co., Ltd. para realizar pruebas de higiene en lugar del método anterior de detección indirecta de cloruro. iones en la vajilla. Además, el método de detección rápida de ATP basado en fotoenzima de insectos también se puede aplicar a la detección en otros campos y usos, como la detección de agua del grifo, la detección de esterilidad del agua embotellada, la detección de Bacillus anthracis en la dieta de campo militar, el monitoreo ambiental, la inspección clínica, etc. .