Preparación de los utensilios utilizados antes de extraer el ARN bacteriano, ¿cómo utilizar puntas de pipeta comunes para convertirse en utensilios libres de enzimas? Por favor dime los pasos específicos, ¡gracias!
Remoje la punta de la pipeta y otras piezas en agua DEPC para su desinfección.
Instrucciones detalladas:
1. La ARNasa existe en todos los tejidos y la piel, los dedos, los reactivos, los recipientes, etc. humanos pueden estar contaminados, por lo que todos los procesos experimentales requieren el uso de guantes. y cámbielo con frecuencia (use guantes desechables).
2. Los recipientes que utilizan vidrio o porcelana (como mortero) deben hornearse en un horno de secado a 200 °C durante más de 2 horas. Para materiales que no se pueden hornear a altas temperaturas, como recipientes de plástico, se puede utilizar una solución acuosa de pirocarbonato de dietilo al 0,1 (DEPC) y luego enjuagar con agua destilada. DEPC es un modificador químico de la RNasa. Reacciona con el anillo de histidina imidazol, el grupo activo de la RNasa, para inhibir la actividad de la enzima. Mezclar DEPC con soluciones de amoníaco puede producir carcinógenos, así que tenga cuidado.
3. Los reactivos utilizados en la prueba también se pueden tratar con DEPC. Agregue DEPC a una concentración de 0,1, luego agite vigorosamente durante 10 minutos, hierva durante 15 minutos o esterilice en autoclave para eliminar el DEPC residual. También se mezclan con adenoides. Las purinas juntas destruyen la actividad del ARNm.
Nota: DEPC reacciona con aminas y grupos sulfhidrilo, por lo que los reactivos que contienen Tris y DTT no pueden tratarse con DEPC. Las soluciones de Tris se pueden preparar en agua tratada con DEPC y luego esterilizarlas en autoclave.
4. Al preparar soluciones que no se pueden esterilizar en autoclave, se puede utilizar agua tratada con DEPC y, en la medida de lo posible, se deben utilizar reactivos sin abrir. Además de DEPC, también se pueden utilizar isotiocianato de guanidinio, complejos de ribonucleótidos de vanadio, proteínas inhibidoras de RNasa, etc. Además, para evitar la adsorción de ARNm o ADNc en las paredes de los recipientes de vidrio o plástico, todos los recipientes deben estar silanizados.
Preparación de DEPC: El DEPC comprado es un líquido. Mezcle 1 ml de DEPC con 1000 ml de agua destilada. Este líquido se puede utilizar para remojar los tubos, puntas, etc. de EP que se utilizan en el proceso de extracción de ARN. Remojarlo durante al menos 24 horas y sacarlo cuando se use, alta presión durante 15 minutos para eliminar la toxicidad del DEPC. Si se usa para preparar una solución, la concentración es una milésima. Después de mezclar y enfriar a alta presión, se puede usar para preparar la solución.