Principios de secuenciación
ABI ha desarrollado un kit de secuenciación didesoxi marcado con fluorescencia (reactivo BigDye) basado en el método de secuenciación didesoxi. Se combinó con electroforesis capilar para producir secuenciadores como el "ABI3730" y el "ABI3500".
Principio:
La primera tecnología central de la secuenciación didesoxi es utilizar ADN polimerasa para agregar didesoxinucleótidos (ddNTP) a la síntesis de cadenas de ADN.
El bloque de construcción natural del ADN es un único desoxinucleótido (dNTP). Las posiciones 3' y 5' del resto de azúcar tienen cada una un grupo hidroxilo. El grupo hidroxilo en la posición 5' está conectado aguas arriba. grupo fosfato. Las repeticiones forman la columna vertebral del ADN.
El enfoque de Sanger consistió en sintetizar químicamente nucleótidos sin grupo hidroxilo en la posición 3', conocidos como didesoxinucleótidos.
Los reactivos de BigDye incluyen cuatro ddNTP, dNTP, ADN polimerasa, iones de magnesio, tampón de pH y más marcados con fluorescencia.
Se purificaron una serie de fragmentos de ADN de diferentes longitudes obtenidos de la reacción para eliminar los nucleótidos individuales fluorescentes libres de ddNTP y luego se secuenciaron en una máquina.
Las ondas ultrasónicas rompen las moléculas de ADN en fragmentos de secuencia de 300-800 pb de largo (el genoma humano se divide en 300-500 pb), usan enzimas para aplanarlos en extremos planos y luego agregan una base A a los 3. ' extremo (debido a que hay un nudo en T que sobresale en el extremo 3'), se agregan aptámeros emparejados complementarios a ambos extremos y se amplifican mediante PCR para alcanzar una cierta concentración para formar una biblioteca de ADN monocatenario.
La celda de flujo es un canal que adsorbe fragmentos de ADN que fluyen y aquí se realiza la secuenciación. Las secuencias que se probarán en la biblioteca construida anteriormente están preconfiguradas a una cierta concentración. Cuando pasen por aquí, serán adsorbidas fuerte y aleatoriamente en el canal bajo la acción de reactivos químicos específicos y se emparejarán con las secuencias cortas anteriores. . Como resultado del muestreo ascendente, los carriles adsorben el ADN lavado y permiten la amplificación por PCR en puente en la superficie.
Primera ronda de plantilla de amplificación: secuencia fijada en la superficie de la celda de flujo--gt; hebra plantilla
Deshibridación: agregue una solución alcalina fuerte de NaOH para desnaturalizar el ADN bicatenario y la hebra complementaria Las secuencias cortas en el carril están fuertemente conectadas y fijas; la cadena plantilla está fija. La doble hebra que ha perdido la conexión del enlace de hidrógeno bicatenario parece estar suspendida y será eluida
**Formación del puente: **Añadir solución tampón, p7' de la hebra complementaria y p7 de los carriles son complementarios (pero aún en un carril), como se muestra en la imagen a continuación (del sitio web de Illumina), el propósito es amplificar rápidamente el hilo conectado en el cruce del carril p7, que es el hilo delantero en la imagen a continuación. , que es el mismo que nuestro hilo plantilla. Solo usamos esta mitad para secuenciaciones futuras.
Illumina utiliza un método de "una base fluorescente a la vez, hasta que se agote" para determinar la secuencia de bases del grupo.
Una ronda de secuenciación se completa de la siguiente manera:
Forward Strand se utiliza para la secuenciación bicatenaria:
Primero, el cebador se une al cebador de secuenciación. sitio 1 (cerca de p5), luego agregue dNTP especiales. Cadena delantera:
Primero, el cebador se combina con el sitio de unión del cebador de secuenciación 1 cerca de p5, y luego se agrega un dNTP especial. El grupo hidroxilo de este dNTP se reemplaza por un grupo azida, para que pueda. solo agregue un dNTP; también contiene un grupo fluorescente que puede excitar diferentes colores; después de agregar dNTP a la cadena sintética, todos los dNTP libres y la ADN polimerasa se eliminarán y luego se agregará el tampón de excitación y se generarán señales de excitación láser. Los dispositivos ópticos registran la señal fluorescente y una computadora convierte la señal óptica en bases de secuenciación.
Siguiente ronda: agregue productos químicos para apagar la señal de fluorescencia, convirtiendo el grupo azida 3' dNTP en un grupo hidroxilo, de modo que pueda continuar agregando una cadena hacia abajo para asegurarse de que esta cadena ya no emita fluorescencia. Esto se repite hasta que se detectan las secuencias de bases de todas las cadenas. De esta forma se obtiene la secuencia de la cadena directa.
Secuenciación del índice: una vez completado el ciclo anterior, el producto leído se elimina por lavado y el cebador del índice 1 es complementario al índice 1 en la cadena para realizar la detección del índice 1. Después de la detección, el producto se eluye para obtener la secuencia índice1. A continuación, se empareja p5 con p5' en el carril y se mide y eluye el índice 2.
Hebra inversa:
Tras la elución del producto índice 2, se realiza una amplificación del puente para obtener la doble cadena, y luego se realiza una desnaturalización para obtener la cadena delantera original y la nueva cadena inversa. hebra y retire la cadena delantera completa. A continuación se desnaturalizan la cadena delantera original y la nueva cadena inversa, la cadena delantera se retira de la prueba y la cadena inversa se une al cebador como la cadena delantera, excepto que se une al sitio de unión del cebador 2 superior.
Extremo único
Solo agregue el índice, el sitio de unión del cebador y P7/P5 a un extremo del fragmento de ADN, conecte directamente P5/P7 al otro extremo y fije el fragmento. en la celda de flujo Realice la PCR en puente. Se generaron grupos de ADN y luego se realizó una secuenciación de un solo extremo para leer las secuencias.