Método de determinación de sulfonamidas en tejido muscular de pescado, cromatografía detallada, texto completo, ¡gracias!

. Se utiliza ampliamente para tratar y prevenir enfermedades del ganado y las aves de corral. El consumo de tejidos animales que contienen sulfadimetoxina provocará reacciones alérgicas en el cuerpo, destruirá el equilibrio ecológico de la flora normal del cuerpo y hará que las bacterias patógenas desarrollen resistencia a los medicamentos |1]. China, la Unión Europea y la FAO/OMS fijaron un límite máximo de residuos de 100 μg/kg para las sulfonamidas en tejidos animales. Después de que las sulfamidas utilizadas en la producción ganadera ingresan al ambiente externo, pueden penetrar en las aguas subterráneas o contaminar los estanques cercanos junto con las aguas residuales o la escorrentía superficial, causando daño a los organismos no objetivo en el ambiente acuático y produciendo veneno. o se acumulan en sus cuerpos

provocando contaminación ambiental [2]. Los residuos de medicamentos en los productos acuáticos resultantes también son motivo de preocupación.

En animales, la sulfadimetoxina se reemplaza principalmente por acetilasa

para formar N sulfametoxina monoacetilada (estado N monoACE-

SM)L3]. En el organismo, N-ACE-SM se convierte de forma reversible en el prototipo del fármaco, volviéndose así farmacológicamente activo. Por lo tanto, también se requiere la determinación de residuos de Na ACE-SM

. En Japón, los identificadores de residuos de sulfametoxina

son la sustancia técnica sulfametoxina y N -ACE-

SMz L6J. Este artículo estableció un método de cromatografía líquida de alta resolución para la determinación del fármaco original de sulfadimetoxina y residuos de sulfadimetoxina acetilada.

lMateriales y métodos

1.1 Materiales de prueba

1.1.1 Sulfadimetoxina estándar, cristal blanco, pureza 99, Sigma Company de Estados Unidos, Acetil Sulfadimetoxina,<; /p>

Cristal blanco, sintetizado en nuestro laboratorio.

1.1.2 Reactivos principales: acetonitrilo, cromatográficamente puro, Fisher Company; ácido acético glacial: puro analítico, Beijing Chemical Reagent Company, n-hexano, sulfato de sodio anhidro; propanol: Todos eran de grado analítico, Beijing Chemical Factory.

1.1.3 Instrumentos y equipos principales Cromatografía líquida de alto rendimiento: Controlador del sistema SCL-10AVP, Dispositivo desgasificador DGU-12A SPDM10AVP

Dispositivo de detección de matriz de diodos, Bomba LC-10ATVP,

estación de trabajo Class-VP (Japón). Corporación Shimadzu). Control de velocidad multifunción

Oscilador: HY-1-4, Changzhou Tonghua Electric Co., Ltd. Homogeneizador de tejidos:

Máquina de suspensión: Nissei AM-6, Japan Ace Company. Evaporador rotativo:

Laborota 4003, Heidolph GmbH, Alemania. Centrífuga:

LD4-2A, Fábrica de Centrífugas Médicas de Beijing. Balanza electrónica: 0,01 mg,

Sartorius. Micropipeta Micropipeta: Beijing Qingyun Aviation Instrument Co., Ltd. Agitador magnético: Tipo 7 8-1, Fábrica de electrodomésticos Zhejiang Yueqing Lesheng. La bomba de vacío de diafragma (GM-0.33) y el filtro de solvente son productos de la fábrica de accesorios de filtro Tianjin Tengda. Columna SPE: Columna de alúmina básica Sep-Pak Vac

12 cc (2 g), Waters Company, EE. UU.

1.2 Método de ensayo

1.2.1 Condiciones cromatográficas Columna: C e columna de cromatografía líquida de fase reversa: C e columna de cromatografía líquida de fase reversa,

Inertsil ODS-3 (4,6 mm x 250 mm, tamaño de partícula 5 m); fase móvil: agua-acetonitrilo-ácido acético (76:24:0,05, detección V/V/V); Nuevo Méjico.

Longitud de onda: 265 nm; volumen de inyección: 50 ttL; caudal: 1 ml/min: 1 ml/min.

1.2.2 Preparación de la solución estándar Pesar con precisión SM y Na

0,010 0 g de cada uno de ACE-SMz, disueltos en acetonitrilo y diluidos a 100

mL, preparados en dos soluciones de almacenamiento estándar de 100 ttg/mL, almacenadas a 20°C

Preservación de la luz. La solución madre estándar se diluyó con acetonitrilo para formar una solución de trabajo estándar con una concentración de 10 µg/ml y se almacenó a 20°C en la oscuridad.

1.2.3 El día de la medición, utilice la solución de trabajo estándar SM de fase móvil y N ACE-SM para diluir a concentraciones de 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,50, 1,00 y 2,00 tg respectivamente. mL de solución de trabajo estándar para dibujar una curva estándar. Para una solución estándar mixta de 50

t*g/mL, se inyectaron 50 L de cada uno en la muestra, luego se inyectaron en la muestra de HPLC y luego se extrajeron en una solución de trabajo estándar con una concentración de 10 mg/mL. Se inyectaron 50 litros de cada solución estándar en las muestras y las áreas de los picos se integraron mediante HPLC.

Luego use la concentración como abscisa y el área del pico como ordenada para dibujar la curva estándar de los dos compuestos anteriores y encuentre la curva de regresión y la relación de correlación.

1.2.4 Pretratamiento de la muestra

1.2.4.1 Extracción y purificación: pelar el músculo de esturión, homogeneizar 15 000 r/lluvia durante 3 min, pesar con precisión 2,00 g de tejido muscular homogeneizado

Agregue 25 ml de acetonitrilo y 4 g de sulfato de sodio anhidro a la suspensión, agite a velocidad media durante 20 minutos y centrifugue a 3 000 r/ll durante 5 minutos. Centrifugar a 3 000 r/lluvia durante 5 ra. Poner el sobrenadante en un embudo de separación de 100 ml lleno con 30 ml

hexano, agitar durante 1 min, dejar reposar durante 20

lluvia y recoger la capa inferior. El residuo separado se extrajo nuevamente con 25 ml de acetonitrilo, se agitó durante 20 minutos y se centrifugó a 3000 r/lluvia durante 5 minutos.

, el residuo se extrajo y se disolvió con 5 ml de monohidrato de acetonitrilo (95:5, V/V).

1.2.4.2 Extracción: Utilice 15 ml de monohidrato de acetonitrilo (95:5,

V/V) para preequilibrar la columna de alúmina básica Sep-Pak Vac de 12 cc (2 g).

Luego cargue la muestra y use 5 ml de acetonitrilo monohidrato (95:

para recolectar; luego recoja y eluya con 5 ml de acetonitrilo y agua (75:25, V/V) para recoger

El eluido se sopló con nitrógeno hasta que estuvo casi seco y el residuo se ajustó a 2,0

ml con fase móvil. La muestra preparada se detectó mediante cromatografía líquida de alta resolución.

1.2.5 Para la determinación de la tasa de recuperación, establezca 3 niveles de adición de tejido de 20, 100 y 2 000 t*g/kg

y configure un control en blanco, 5. líneas para cada nivel

Pese 2,00 g de tejido muscular homogeneizado y agregue un cierto volumen de

solución de trabajo estándar para que las concentraciones del fármaco en el tejido muscular sean 20,

100 y 2 000 t*g respectivamente/kg, agitar durante 1 minuto, dejar reposar durante 10 minutos y luego proceder al análisis por HPLC según el

método de pretratamiento

1.2.6 Determinación del límite de detección Tome 10 muestras en blanco de músculo de esturión, cada muestra

Pese con precisión 2,00 g de músculo en blanco, procese según el método de pretratamiento de la muestra

, y medir El valor de ruido de referencia se obtuvo y calculó en función de la relación señal-ruido de 3, y se obtuvo el límite de detección de tejido muscular de esturión SM y Na ACE-SM2

1,2 .7.

1.2.7 Determinación de la precisión Dentro de los 3 días, pesar con precisión el homogeneizado

Tejido 2,00 g/día, agregar un volumen determinado de solución estándar tres veces para cada concentración.

, de modo que las concentraciones de SM y Na ACE-SM en el tejido sean 20, 100 y 2 000 t, g/kg respectivamente. Vortex durante 1 min. Las concentraciones de Na ACE-SM son 20, 100 y 2 000 t, g/kg respectivamente. Vortex durante 1 min. Las concentraciones de SM y Na ACE-SM en el tejido son 20, 100 y 2 000 t. , g/kg respectivamente. Luego, siga el método de pretratamiento de muestra. Tome 5 muestras para cada concentración

E y repita la inyección 5 veces para cada muestra. Las 3

concentraciones añadidas anteriores se repiten 3 veces cada una. Calcule el producto de superficie máxima

de cada componente y calcule el error promedio y

estándar de las tasas de recuperación de los dos medicamentos dentro y entre El.

2 Resultados

2.1 Curva estándar

Bajo las condiciones cromatográficas seleccionadas, determine la solución de trabajo estándar de sulfadimetoxina y sulfadimetoxina N-acetilada preparada anteriormente. Como se muestra en la Tabla 1, los cromatogramas de los estándares

y las muestras se muestran en la Figura 1.

Tabla 1 SM:, N'aACE-SM: ecuación de regresión de curva estándar y

Tabla 1 SM 2 y N'-ACE-SM2 ecuación de regresión de curva estándar y

Coeficiente de correlación

2.2 Límite de detección

De acuerdo con los valores de ruido de referencia de 10 tejidos en blanco, encuentre el valor promedio de ruido

, use The El límite de detección se calcula como 3 veces el ruido promedio y el límite de detección del tejido muscular es SM, N-ACE-SM y N-ACE-SM.

2.3 Tasa de recuperación y precisión de los picos

La prueba de la tasa de recuperación de picos se realizó en muestras de músculo de esturión y las concentraciones de prueba fueron 20, 100 y 2000 ttg/kg (baja, media, alto)

.

Tabla 2 Tasas de recuperación de SM: y N4_ACE-SM: en tejido muscular de esturión

Tasa de recuperación adicional (n-5)

Tabla 2 Recuperación de músculos fortalecidos tasas de SM2 y N4_ACE-SM2

3 Discusión

3.1 Extracción de muestras

Acerca de la extracción de sulfadimetoxina y N-acetilo del tejido muscular Sulfadimetoxina

Métodos para dimetilpirimidina, se informa que la mayoría de los métodos de extracción utilizan cloruro de metileno (MCA), acetonitrilo o metafosfato-metanol (2:1, V/V) como disolvente de extracción

. [Como disolvente de extracción. Cuando se usa cloruro de metileno como solvente de extracción, el tejido flota en la superficie del solvente de extracción y es difícil verterlo como solvente de extracción, lo que requiere mucho tiempo y es laborioso porque el solvente contiene una gran cantidad de; se utiliza agua; se utiliza acetato de etilo. La eficiencia de extracción es la más alta, pero también extrae las sustancias tisulares más endógenas. La purificación del tejido es difícil y el método de purificación necesita más investigación. El uso de acetonitrilo

como disolvente de extracción tiene una baja eficiencia de extracción, pero aumentar la cantidad de disolvente de extracción

puede obtener una tasa de recuperación satisfactoria. Además, el uso de acetonitrilo para extraer***. p>

También hay menos impurezas. Después de ensayos repetidos, el analito objetivo se puede extraer con 25 ml de acetonitrilo 2 veces.

La precipitación de sales puede promover la precipitación de solutos, mejorando así el efecto de extracción de los disolventes orgánicos

. En este experimento, agregar NazSO anhidro al solvente de extracción mejoró la eficiencia de extracción

de la sulfadimetoxina y la sulfadimetoxina N-monoacetilada

, cuando se agrega NaSO a 4 g, el La tasa de recuperación ya no aumenta.

Por lo tanto, se selecciona que la cantidad añadida de sulfato sódico anhidro sea de 4 g.

3.2 Purificación de la muestra

La purificación de la muestra es un paso clave en el paso de pretratamiento de la muestra, en el que la selección del tipo de columna de extracción en fase sólida es particularmente importante, ya que está directamente relacionada con la tasa de recuperación del método

p>

.

La columna SPE reportada en la literatura para purificación incluye una columna C [3]. La columna de alúmina básica utilizada en este método es una columna de fase normal y el coeficiente de viscosidad del disolvente de elución es pequeño, se seca. rápidamente en su estado natural y es fácil de operar.

3.3 Detección

Los métodos de detección de sulfas reportados en la literatura incluyen detectores ultravioleta, detectores de luz fluorescente

y detectores electroquímicos. Los electrodos de los detectores electroquímicos tardan mucho en estabilizarse y las impurezas de la muestra pueden contaminar fácilmente los electrodos. Los detectores de fluorescencia

son más sensibles y selectivos que los detectores UV. SM

La divatización con fluorescamina producirá productos fluorescentes, pero NI

ACE-SM no se puede derivatizar con fluorescamina, lo que limita la aplicación de detectores de fluorescencia

. El detector UV es el detector más utilizado para la determinación de sulfamidas.

Se puede medir directamente sin derivatización, lo cual es simple y rápido. Utilizamos un detector de matriz de diodos y seleccionamos la longitud de onda de máxima absorción en los espectros de los dos fármacos como longitud de onda de medición.

3.4 Tasa de recuperación y límite de detección

Bajo las condiciones de este experimento, se detectaron sulfadimetoxina y sulfadimetoxina N-acetilada en tejido muscular de esturión a 20ºC. Los límites de detección en los rangos de concentración de 100 y

2000 tttg/kg son ambos 10,0 "g/kg. Ho-rie et al7 informaron sobre un método para la determinación de estos dos fármacos en el músculo. El límite de detección de este El método es 20,0 gg/kg, que es menor que el reportado en la literatura; la tasa de recuperación es cercana a la reportada en la literatura, pero la operación de este método es relativamente simple.

3.5 Precauciones de operación<. /p>

Las sulfonamidas sufrirán una degradación y oxidación parcial en condiciones como altas temperaturas, luz directa y exposición al aire.

Por lo tanto, durante las operaciones de extracción y purificación de muestras.

, intentar ser lo más seguro posible evitar la luz y operar a una temperatura ambiente inferior a 25°C

, y los utensilios utilizados deben ser lo más marrones posibles

y las soluciones estándar. las soluciones de muestra deben almacenarse en condiciones de refrigeración para evitar la luz; las soluciones de muestra también deben analizarse lo antes posible. Los resultados de las pruebas muestran que la solución estándar de 100 ttg/ml se puede almacenar durante 6 meses a 20 °C en la oscuridad. /p>

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