¿El componente de las proantocianidinas en las semillas de uva es "polifenoles" o "flavonoides"?
1 Método de extracción de proantocianidinas
La tasa de extracción de proantocianidinas en materias primas vegetales está estrechamente relacionada con las condiciones de la materia prima y las condiciones de extracción. El almacenamiento, el secado, el grado de molienda, el disolvente de extracción y la temperatura de las materias primas vegetales pueden provocar cambios en la estructura química y la tasa de extracción de las proantocianidinas, cambiando así las propiedades físicas y químicas y las actividades biológicas de las proantocianidinas.
Al medir el contenido de proantocianidina en materias primas, cuanto mayor sea el tiempo de almacenamiento, menor puede ser el resultado de la medición. Al mismo tiempo, la humedad de la muestra también reducirá los resultados de la medición. Además, las diferentes condiciones de secado también provocarán cambios en la tasa de extracción. Es mejor utilizar la liofilización para evitar altas temperaturas.
Las muestras suelen triturarse antes de su extracción. Por lo general, el polvo fino es beneficioso para la extracción, pero si es demasiado fino, la tasa de extracción disminuirá.
La elección del agente de extracción también es un factor clave que afecta la tasa de extracción. Dado que las proantocianidinas suelen formar complejos moleculares estables con proteínas y polisacáridos en las plantas en forma de enlaces de hidrógeno y enlaces hidrófobos, lo mismo ocurre con las moléculas de proantocianidinas. Por lo tanto, el extractante de proantocianidina no sólo debe tener buena solubilidad, sino también tener la capacidad de romper enlaces de hidrógeno. Por lo tanto, un sistema compuesto de solvente orgánico y agua (el solvente orgánico representa del 50% al 70% del volumen total) es el más adecuado para la extracción. El orden de capacidad de extracción de los disolventes orgánicos es propanol.
Cuando el contenido de iones metálicos como el hierro en muestras de plantas es grande, las proantocianidinas se complejarán y precipitarán con iones metálicos en condiciones neutras, lo que no favorece la extracción. . En este momento, se debe utilizar disolvente acidificado para romper los enlaces hidrofóbicos y de hidrógeno entre las proantocianidinas y las proteínas, los polisacáridos y sus propios iones por un lado, y por otro lado para romper los enlaces complejos de las proantocianidinas y los iones metálicos para mejorar la extracción. tasa.
1.1 Extracción tradicional con disolventes orgánicos
En 1991, Ayroles et al. inventaron un método para extraer proantocianidinas de las hojas de Ginkgo utilizando compuestos cetónicos acuosos como agente de extracción. Como agentes de extracción se utilizan soluciones acuosas de cetonas. Después de filtrar el extracto, use álcali para ajustar el valor de pH del filtrado a aproximadamente 9 para precipitar las proantocianidinas, y luego use ácido para ajustar el valor de pH del filtrado a aproximadamente 2. En presencia de (NH4)SO, use cetonas C ~ C para extraer las proantocianidinas en el filtrado, eliminar los compuestos cetónicos y secarlos.
Romanczyk et al. inventaron que al extraer proantocianidinas del cacao, los granos de cacao desgrasados se extraían con una fracción en masa del 70% de MeOH/agua desionizada, y luego se extraían con una fracción en masa del 70% de acetona/agua desionizada. se concentró al vacío, se eliminó el disolvente orgánico, se disolvió en agua, se extrajo con CHCl, se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo, luego se concentró al vacío para eliminar el acetato de etilo y la fase acuosa se liofilizó.
1.2 Tecnología de extracción de agua y solvente verde
Dado que los solventes orgánicos como la acetona pueden causar contaminación ambiental y residuos orgánicos tóxicos en los productos, la gente está desarrollando vigorosamente una tecnología de extracción verde amigable con el medio ambiente. 1998 Duncan y Gilmour inventaron un método para extraer proantocianidinas de materiales vegetales (cortezas, hojas, semillas de uva, pieles, soja y té verde). Triturar las materias primas (≤15 mm), extraer con agua caliente desoxigenada (1 min ~ 20 h) bajo presión normal, 60°C ~ 100°C o alta presión, filtrar con ultrafiltración u ósmosis inversa o ambas, y concentrar. Este método extrae principalmente proantocianidinas solubles en agua con un peso molecular ≤ 5 000 D. El rendimiento está entre el 0,5 % y el 10,0 %, normalmente entre el 6,5 % y el 9,6 % (dependiendo del lugar de muestreo). Proantocianidinas B, B, B, C. separación. El producto obtenido tiene un efecto inhibidor significativo sobre la oxidación del ácido linoleico inducida por AAPH, y la tasa de inhibición a 1 g/ml anal puede alcanzar el 70% ~ 79%. Las pruebas toxicológicas mostraron que el grupo de dosis de peso corporal humano y el grupo de dosis de 100 veces el peso corporal humano no tuvieron efectos tóxicos o secundarios dentro de las 24 horas, y la prueba toxicológica crónica (5 meses) no tuvo efectos tóxicos o secundarios obvios.
En 1999, Karim y otros inventaron el método de utilizar agua desionizada para presurizar y desoxigenar para extraer proantocianidinas de materias primas vegetales. Después de la ultrafiltración del extracto, se seleccionó para la elución la cromatografía en columna utilizando resina polimérica microporosa hidrófoba como carga y el eluyente polar (etanol + agua). El etanol se eliminó del eluato mediante ósmosis inversa y las proantocianidinas se obtuvieron mediante secado.
1.3 Tecnología de extracción con fluidos supercríticos
Sun Chuanjing y otros inventaron un método para extraer proantocianidinas de las hojas de Ginkgo utilizando un modificador polar compuesto de dióxido de carbono supercrítico, acetona y agua. En condiciones de temperatura de extracción de 60 °C ~ 90 °C y presión de extracción de 20 MPa ~ 35 MPa, agregue la modificación polar con una proporción en volumen de acetona a agua de (50 % ~ 80 %): (50 % ~ 20 % ) agente, y realizar extracción estática y dinámica durante 2 h a 4 h. El extracto se concentra con resina tradicional y se seca por aspersión para obtener extracto refinado de hoja de ginkgo. Este producto contiene glucósidos de flavonoides de ginkgo > 35 g/100 g, lactonas terpénicas >: 8 g/100 g, proantocianidinas < 7 g/100 g y ácidos fenólicos < 5 mg/kg. La ventaja de este método es que el proceso es corto y puede extraer las proantocianidinas antioxidantes naturales más fuertes. En 2000, Sun Chuanjing y otros inventaron un método para la extracción con CO supercrítico de aceite de semilla de grosella negra y oligómeros de proantocianidina. El método se divide en dos pasos: el primer paso es extraer aceite de semilla de grosella negra con CO supercrítico y controlar la presión de extracción a 25 MPa. - 29 MPa, la temperatura es 60 °C; en el segundo paso, agregue el modificador al CO2 supercrítico, la proporción en volumen de acetona a agua es 70: 30, la proporción en volumen de flujo de CO al modificador es 4: 1, y la presión es de 22 MPa ~ 25 MPa, temperatura 60 ℃, extrae proantocianidinas oligoméricas. El rendimiento de aceite de semilla de grosella negra fue de 65438 ± 06% y el rendimiento de oligómero de proantocianidina fue de 4%. La ventaja de este método es que se obtienen dos productos al mismo tiempo, el proceso es simple y confiable, el CO y los modificadores se reciclan, no hay residuos de solventes en el producto y no hay contaminación para el medio ambiente.
1.4 Tecnología de extracción por microondas
Liu Zhengtao y otros inventaron un nuevo método para extraer proantocianidinas de semillas de uva, es decir, utilizando agua y un alcohol con una longitud de cadena de carbono de C ~ C Trate las semillas de uva con microondas a una frecuencia de 2450 MHz o 915 MHz y una potencia de 500 W ~ 15 000 W en solventes como éter, acetona, acetato de etilo, tolueno o sus mezclas. En comparación con los métodos químicos tradicionales, este método es simple, eficiente, rápido, de bajo costo y tiene menos descarga de líquidos residuales.
1.5 Método de extracción acuosa de dos fases
Desde el descubrimiento del sistema acuoso de dos fases por Albertsson de la Universidad de Lund en Suecia en 1956 hasta la aplicación de la extracción acuosa de dos fases y Tecnología de separación de Kula y otros de GBF en Alemania en 1979. Aunque la separación de productos biológicos solo tiene una historia de más de 20 años, debido a sus condiciones suaves y su fácil amplificación, se ha utilizado con éxito en la separación y purificación de productos biológicos. como proteínas, ácidos nucleicos y virus. En los últimos años, ha habido informes sobre el uso de tecnología de extracción acuosa de dos fases para extraer ingredientes activos de hierbas medicinales chinas. Aunque el número es pequeño, los ejemplos existentes demuestran plenamente que tiene buenas perspectivas de aplicación. El estudio de enriquecimiento y separación del extracto de hoja de Ginkgo utilizando un sistema de extracción acuosa de dos fases mostró un buen coeficiente de distribución y efecto de separación. Se cree que el sistema acuoso de dos fases tiene las ventajas de una rápida separación de fases, una baja temperatura de funcionamiento y un punto de espera fácil. El PEG y la sal utilizados son inofensivos para el cuerpo humano y el medio ambiente, y la tasa de extracción es alta. es un método eficaz para enriquecer y separar los flavonoides del ginkgo. Aunque la aplicación de la tecnología de extracción acuosa de dos fases en la investigación de extracción de medicinas herbarias chinas aún está en sus inicios, se espera que la aplicación de esta tecnología proporcione nuevas ideas para extraer ingredientes activos de productos naturales.
2 Purificación y separación de proantocianidinas
2.1 Método de extracción en fase líquida
La mayor parte de la purificación de proantocianidinas utiliza disolventes orgánicos de múltiples etapas como acetato de etilo y tolueno. , dicloro metano, éter, etc. se utilizan para la extracción en fase líquida. Este método puede causar contaminación al medio ambiente debido al uso de una gran cantidad de solventes orgánicos y también puede causar fácilmente residuos orgánicos tóxicos en el producto.
2-2 Cromatografía en columna
La mayoría de los métodos de purificación utilizados actualmente son la cromatografía en columna. Wang Jianqing et al. utilizaron resina PVPP como relleno de cromatografía en columna y acetonitrilo como fase móvil para purificar el extracto de acetona de proantocianidinas de cebada.
Ricardo da Silva y otros utilizaron metanol para extraer la uva. Después de recuperar el metanol del extracto, se separó inicialmente utilizando una columna de poliamida.
Primero lave el ácido fenólico con agua neutra, luego use acetonitrilo/agua con una proporción en volumen de 30:70 para eluir las catequinas y use acetona/agua con una proporción en volumen de 75:25 para eluir las proantocianidinas para la purificación.
Liu Rui y otros utilizaron resina macroporosa para purificar proantocianidinas en sorgo con una solución acuosa de etanol y obtuvieron proantocianidinas oligoméricas con una pureza del producto superior a 95 g/100 g.
2.3 Método de extracción en fase sólida
La extracción en fase sólida es uno de los métodos más eficaces para extraer selectivamente los componentes necesarios de sistemas complejos. 1999 Lazarus et al. utilizaron el método SPE para purificar proantocianidinas de piel de almendra, jugo de uva y vino tinto. Las condiciones son: columna de extracción en fase sólida supelcosil Envi-18 de 20 ml, fase móvil: acetona: agua: ácido acético = 70: 29,5: 0,5 (relación de volumen). Kennedy y Waterhouse utilizaron una columna C-18 con agua y metanol como fase móvil para las proantocianidinas en el vino tinto. Las proantocianidinas extraídas se purifican mediante elución para eliminar ácidos orgánicos, azúcares y otros compuestos que son insolubles en la fase orgánica.
Cromatografía en gel 2,4
La cromatografía en gel también se utiliza habitualmente para purificar proantocianidinas. SephadexLH-20 es un gel de hidroxipropildextrano con alta afinidad por los flavonoides. En la actualidad, la purificación y separación de proantocianidinas utiliza principalmente cromatografía en gel Sephadex LH-20. Sin embargo, las propiedades físicas del gel Sephadex LH-20 determinan que no pueda separar proantocianidinas de manera efectiva. Por lo tanto, se debe realizar una purificación y separación adicionales mediante cromatografía de filtración en gel o cromatografía líquida de alta resolución.
Además, como polímero de glucano con un tamaño de partícula promedio de 1,3 m, Sepherdex 75HR también se utiliza para la purificación y separación de proantocianidinas y puede soportar una contrapresión de más de 1,8 MPa. Aunque las columnas comerciales de este material se utilizan comúnmente para separar proteínas, se descubrió que su capacidad para separar proantocianidinas era superior a la de Sephadex LH-20. McMurrough y Madigan concentraron el extracto de cebada y lo sometieron directamente a cromatografía de filtración en gel de alto rendimiento (Sepherdex 75HR) eluyendo con metanol. Según la detección UV, se recogió el eluato y cada fracción se identificó mediante DMACA. Escribano-bail6n et al. purificaron proantocianidinas de semillas de uva utilizando Sephadex LH-20 y RP-HPLC semipreparativa.
Rigaud et al. utilizaron cromatografía de permeación en gel (GPC) TSK G 2500 Hxl y TSK G3000 Hxl y extractos purificados de cacao y semillas de uva utilizando tetrahidrofurano (caudal 1 ml/min).
2.5 Método de fermentación microbiana
Ariga et al. inventaron una levadura activa que puede fermentar y eliminar el almidón en el extracto obtenido mediante extracción con agua y disolventes orgánicos para lograr el propósito de purificar las proantocianidinas; También se encontró que los iones metálicos de las proantocianidinas purificadas también podían eliminarse bien. Si el extractante es agua y agua/etanol, la fermentación se puede concentrar directamente. Si el extractante es acetona, se debe eliminar antes de la fermentación. Las levaduras más utilizadas incluyen: levadura de vino, Saccharomyces cerevisiae y cepas de levadura injertadas.
2.6 Cromatografía a contracorriente de alta velocidad
La cromatografía a contracorriente de alta velocidad fue propuesta por el Dr. Ito Yoshichiro del Colegio Médico Nacional de Estados Unidos en la década de 1960. Originalmente era una técnica de cromatografía preparativa, un tipo de cromatografía de partición líquido-líquido sin vehículos ni soportes sólidos. La separación se basa principalmente en la capacidad de distribución de compuestos en dos fases inmiscibles. Tiene alta eficiencia de separación, alta pureza del producto, sin adsorción de portador ni contaminación de la muestra, gran volumen de preparación, bajo consumo de solvente y condiciones de operación simples (temperatura ambiente, inerte). material de columna de politetrafluoroetileno). Ha sido ampliamente utilizado en la preparación y análisis de medicinas naturales.
En la actualidad, la cromatografía a contracorriente de alta velocidad se ha desarrollado con éxito en dos series: tipo analítico y tipo preparativo. En otras palabras, la cromatografía a contracorriente de alta velocidad se puede utilizar no sólo para la preparación y separación de ingredientes farmacéuticos naturales, sino también para la cuantificación. El volumen de la muestra varía desde unos pocos miligramos hasta varios gramos, y el volumen de la muestra varía desde unos pocos mililitros hasta decenas de mililitros. No sólo es adecuado para la separación de compuestos no polares, sino también para la separación de compuestos polares. Es adecuado tanto para la separación en bruto de componentes funcionales de productos naturales como para su posterior refinamiento y purificación.
2-7 Tecnología de impresión molecular
La tecnología de impresión molecular es una tecnología de separación altamente selectiva que surgió a finales del siglo XX.
Debido a que el MIT imita los principios de acción clave en biología, los materiales producidos son altamente selectivos y, por lo tanto, encuentran aplicaciones en separaciones quirales y separaciones selectivas de sustrato, extracción en fase sólida, sensores químicos o biológicos, catálisis asimétrica y simulaciones enzimáticas. en muchos campos relacionados. En comparación con los métodos tradicionales, el método MIT tiene las ventajas de alta eficiencia, velocidad y especificidad. El MIT desempeña un papel incomparable en las separaciones quirales. Según las estadísticas, el 60% de los fármacos existentes tienen uno o más centros quirales, y la eficacia y el impacto en el cuerpo humano varían mucho entre los enantiómeros. Por ello, en 1992 la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. estipuló que en el futuro los isómeros ópticos deberán separarse de los fármacos con centros asimétricos. En comparación con los métodos tradicionales, los métodos MIT son muy valiosos. P & gt
En 2002, Zhou Li et al. prepararon un polímero impreso molecularmente utilizando quercetina como plantilla, separaron la quercetina y la isorhamnetina del extracto crudo de espino amarillo y obtuvieron buenos resultados. Xie Jianchun et al. utilizaron acrilamida como monómero funcional y quercetina como plantilla en un disolvente polar para preparar polímeros impresos molecularmente mediante un método no valente. Los experimentos de cromatografía líquida mostraron que el polímero impreso molecularmente tenía afinidad específica por la quercetina. El hidrolizado del extracto de hoja de Ginkgo se aisló directamente del polímero impreso molecularmente para obtener un componente que contenía principalmente quercetina como plantilla y kaempferol, un compuesto con una estructura similar a la quercetina. Este estudio confirmó la viabilidad de la tecnología de impresión molecular para aislar y extraer directamente compuestos con efectos específicos de la medicina herbaria china.