Entonces, ¿cómo eliminar la RNasa del ADN?
(1) La cristalería, los productos de plástico y los productos de plástico desechables después de la esterilización de los tanques de electroforesis básicamente no contienen ARNasa y pueden usarse directamente para la preparación y conservación de ARN. No se requiere procesamiento previo. Los productos de vidrio y plástico comunes que se utilizan en los laboratorios a menudo se tiñen con RNasa. Deben hornearse en seco a 180 °C durante más de 8 horas (cristalería) o enjuagarse con cloroformo (productos de plástico) antes de su uso. Debe hornearse en seco a 180 °C durante 8 horas o más (cristalería) o enjuagarse con cloroformo (plásticos) antes de su uso. Otro método consiste en remojar vasos de precipitados, tubos de ensayo y otros elementos utilizados para preparar ARN en una solución acuosa de pirocarbonato de dietilo al 0,1% (DEPC es un fuerte inhibidor de la RNasa, pero su efecto no es absoluto (Fedorcsak y Ehrenberg, 1966). ). Los recipientes de vidrio o plástico que contenían DEPC se mantuvieron a 37 °C durante 2 h, se empaparon varias veces en agua esterilizada y se secaron a 100 °C durante 15 min (Kumar y Lindberg, 1972). Autoclave a 15 psi (1.034x105Pa) durante 15 minutos. El tratamiento anterior elimina trazas de DEPC de los orgánulos, evitando que DEPC altere las bases purínicas del ARN mediante carboximetilación.
El tanque de electroforesis utilizado para la electroforesis de ARN debe limpiarse con detergente, enjuagarse con agua, secarse con etanol, luego inyectarse con una solución de H2O2 al 3%, dejarse a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego llenarse con una solución al 0,1%. Agua tratada con DEPC Enjuague bien el tanque de electroforesis. Es una buena idea reservar algunos objetos de vidrio, plásticos y tanques de electroforesis, etiquetarlos con etiquetas especiales y almacenarlos en un lugar designado para su uso en experimentos de ARN.
(2) Contaminación por investigadores La fuente potencial más importante de contaminación de la RNasa son las manos de los investigadores. Por lo tanto, al preparar materiales y soluciones para aislar y analizar ARN, todas las operaciones que involucren principalmente ARN deben usar guantes desechables. Después de entrar en contacto con cristalería "grasa" y otros artículos, los guantes pueden estar contaminados con RNasa, por lo que los experimentos con ARN deben reemplazarse. tiempo.
(3) Solución contaminada Prepare una solución utilizando agua esterilizada en autoclave y reactivos químicos dedicados a la investigación del ARN, pese los reactivos con una cuchara para hornear seca y vierta la solución en un recipiente de vidrio sin ARNasa. Cuando sea posible, las soluciones deben tratarse con DEPC al 0,1 % a 37 °C durante al menos 12 horas y luego calentarse a 100 °C durante 15 minutos o esterilizarse con vapor a alta presión de 15 lbf/in2 (1,034 x 105 Pa) durante 15 minutos. NOTA: DEPC reacciona rápidamente con aminas y, por lo tanto, no se puede utilizar con el tampón Tris I. Se pueden almacenar varias botellas sin abrir de cristales de Tris frescos para preparar soluciones sin ARNasa.
(2) Si ha sido contaminada, se pueden añadir inhibidores de la RNasa.
(1) El inhibidor de la proteína RNasa es una proteína aislada de la placenta humana y puede interactuar con muchas Dos RNasas (KI ≈3x1010) se combinan estrechamente para formar un complejo equimolar unido de forma no valente, que inactiva la RNasa. Esta proteína puede actuar in vivo como inhibidor de la angiopoyetina, un factor angiogénico cuya secuencia de aminoácidos y presunta estructura terciaria es similar a la RNasa pancreática y se vende con diferentes nombres comerciales por varios fabricantes; debe colocarse en glicerol al 50% que contenga 5 mmol/L. ditiotreitol (DTT) y se almacenó a -20°C. Los productos inhibidores deben desecharse después de congelarlos y descongelarlos varias veces o exponerlos a condiciones oxidantes, ya que estos tratamientos desnaturalizan la proteína y liberan la ARNasa unida. Por lo tanto, este inhibidor de proteínas no debe usarse durante los pasos iniciales de la extracción de ARN de células de mamíferos lisadas con desnaturalizantes. Sin embargo, este inhibidor debe usarse cuando se utilizan métodos de lisis más suaves y esta proteína debe estar presente en todos los pasos posteriores de purificación de ARN. Dado que la extracción con fenol elimina los inhibidores de proteínas, se deben agregar inhibidores varias veces durante el proceso de purificación. Su máxima actividad requiere el uso de reactivos de sulfhidrilo y no interfiere con la transcripción inversa o la traducción de ARNm en sistemas libres de células.
(2) Complejo de vanadil ribonucleósido. Este complejo está formado por iones de vanadio (1V) y cualquiera de los cuatro ribonucleósidos. Es un análogo del estado de transición que puede unirse a una variedad de RNasas y puede inhibir la RNasa. actividad 100%. Estos cuatro complejos de vanadil ribonucleósido se unen a células intactas y se utilizan en todos los procedimientos de extracción y purificación de ARN en una concentración de 10 mmol/L. El ARNm resultante se puede traducir directamente en ovocitos simulados y se puede utilizar como plantilla para determinadas reacciones facilitadas por exoenzimas, como la transcripción inversa del ARNm. Sin embargo, el complejo vanadil ribonucleósido inhibe fuertemente la traducción del ARNm en sistemas libres de células y debe eliminarse mediante extracciones múltiples con fenol que contenga 0,1 % de hidroxiquinolina [equilibrado con 0,01 mol/l de Tris.Cl (pH 7,8)]. Varias empresas venden complejos de vanadil ribonucleósido.
(3) Macaloid (en diatomeas) Macaloid es un tipo de arcilla que se descubrió hace muchos años para adsorber la enzima ARN. Se convierte en una suspensión con una solución tampón y se utiliza para lisar las células hasta la concentración final. es 0,015 % (p/v). Esta arcilla y su RNasa adsorbida se pueden eliminar mediante centrifugación durante la purificación posterior del ARN (por ejemplo, después de la extracción con fenol).
(iii) Se puede añadir clorhidrato de guanidina o solución de tiocianato de guanidina para extraer ácidos nucleicos. Las soluciones de clorhidrato de guanidina o tiocianato de guanidina disuelven rápidamente las proteínas, protegiéndolas así de las RNasas.