Citometría de flujo, pequeño duende molesto

La citometría de flujo (FCM) es una tecnología para el análisis cuantitativo rápido y la clasificación de células u otras partículas biológicas dispuestas en una sola columna en un flujo de fluido, una a una.

1. El camino de la pequeña hada hacia la inmortalidad

2. Tipos de muestras

El citómetro de flujo puede detectar una variedad de muestras: sangre periférica, médula ósea, células Punción fluido, eluato, tejido sólido, células cultivadas, microorganismos.

3. Principio de funcionamiento

El citómetro de flujo consta principalmente de 3 partes: sistema de flujo de líquido, sistema óptico y sistema electrónico. Después de la tinción fluorescente, las células que se van a probar se presionan en la cámara de flujo bajo una cierta presión de gas. Bajo el líquido de la envoltura, las células que se van a probar se organizan en una sola fila y pasan a través del área de detección en secuencia. Las células serán irradiadas por el rayo láser. Produce luz dispersa y fluorescencia excitada. Ambas señales son recibidas simultáneamente por el tubo fotomultiplicador (PMT). Después de recibirlo, se puede convertir en señales eléctricas y luego pasar a través del convertidor analógico/digital para convertir las señales eléctricas continuas en señales digitales que la computadora pueda reconocer.

4. Aplicación de la citometría de flujo

5. Puntos a tener en cuenta durante la operación

1. Preprocesamiento

Cuidado con la fluorescencia extinción

El tiempo de incubación debe seguirse estrictamente durante la operación. Si el anticuerpo se incuba durante demasiado tiempo, la fluorescencia se apagará gradualmente. ¿Y qué pasa si hay que posponer el experimento? Puedes poner el tubo de ensayo en hielo, lo que prolongará ligeramente el tiempo de enfriamiento.

Preste atención al orden de tinción.

Al realizar la tinción multifluorescente, las mismas células tendrán diferencias en la intensidad de la fluorescencia debido a los diferentes órdenes de tinción. La solución es: preexperimento. Haga una serie de muestras con diferentes secuencias de tinción y compare y analice las distintas muestras antes y después de la tinción para determinar el impacto de la secuencia de tinción en las células.

Elija un buen esquema de tinción.

Un esquema de tinción poco razonable también puede provocar que la señal de tinción fluorescente sea demasiado débil. Solución: Pre-experimento. Antes de iniciar oficialmente el experimento, diseñe un plan de teñido perfecto mediante experimentos preliminares. (Considere otros factores como el tipo de reactivo, la calidad del reactivo, la dosis del reactivo, el tiempo de incubación, los tiempos de lavado, la concentración de tinte, el tiempo de teñido y la temperatura de teñido).

Realice experimentos de control negativo y de control de isotipos

Los controles negativos de células pueden mostrar niveles de fluorescencia basales celulares.

Los controles de isotipo se utilizan para comprobar el nivel de unión no específica de los anticuerpos. Al seleccionar controles de isotipo, debe prestar atención a utilizar la misma especie, el mismo subtipo, el mismo tinte y la misma concentración, de lo contrario, aparecerán resultados de control de isotipo desordenados durante la prueba.

Elección del anticuerpo adecuado

El principio general es: elegir el fluoróforo con el índice de tinción más alto para el antígeno expresado más débil. Elija según el rendimiento del citómetro de flujo, el láser y el tipo de filtro utilizado. Para experimentos multicolores, elija tintes con una pequeña superposición en los espectros de emisión.

2. Configuración de parámetros

La adquisición de datos debe realizarse sobre la base de una calibración calificada del rendimiento del instrumento.

Los ajustes del voltaje del tubo fotomultiplicador, la ganancia, la compensación de color y otros parámetros para las señales de luz dispersa y fluorescencia del instrumento afectarán directamente los resultados.

Voltaje

El voltaje debe ajustarse según el tubo de control negativo.

Umbral

Se puede utilizar cualquier parámetro o combinación de múltiples parámetros como umbral; se puede configurar FSC/SSC para la mayoría de las muestras; las señales por debajo del umbral no se pueden almacenar; Se puede utilizar un tubo para ajustar.

El propósito es restar señales de impurezas innecesarias, señales de ruido, señales de células inútiles, etc., de modo que se recopilen todas las señales útiles.

Compensación

A menudo se utilizan más de dos anticuerpos marcados fluorescentemente para la tinción en el análisis de citometría de flujo, y existe una cierta superposición en los espectros de emisión de los distintos tintes fluorescentes utilizados actualmente. La compensación de fluorescencia elimina del detector cualquier señal de fluorescencia que no sea la correspondiente.

Método de compensación: Ajustable entre dos canales cualesquiera.

Ajuste de compensación: Ajuste según el tubo de control de un solo color.

6. Análisis de datos

El citómetro de flujo analiza diversos parámetros de las células a través de señales luminosas. Las señales luminosas incluyen señales luminosas dispersas y señales fluorescentes. La señal de luz dispersa incluye dispersión directa (FSC, tamaño de celda reflectante) y dispersión lateral (SSC, granularidad de celda reflectante). Las señales de fluorescencia se pueden utilizar para reflejar características químicas como la expresión de antígenos de las células.

Existen muchos tipos de gráficos de flujo, los más utilizados son los histogramas de flujo y los diagramas de dispersión de flujo.

Histograma

Un histograma de transmisión solo puede mostrar información de un canal.

La abscisa representa la intensidad relativa de la señal de fluorescencia o señal de luz dispersa. La unidad es logarítmica y puede ser una coordenada lineal o logarítmica. La ordenada es generalmente el número de celdas.

Gráfico de dispersión

La coordenada X es el contenido relativo de un parámetro de la celda y la coordenada Y es el contenido de otro parámetro de la celda, que puede separar subpoblaciones de celdas.

FSC y SSC son dos parámetros muy básicos en citometría de flujo. El valor de FSC puede representar el tamaño de la célula. Cuanto mayor es el volumen de la célula, mayor es el FSC. El SSC representa la granularidad de las células. Cuanto más grandes son los orgánulos y la granularidad de la célula, mayor es el SSC. Al analizar las células de sangre periférica, las características de FSC y SSC se pueden utilizar para clasificar las células en linfocitos, monocitos y granulocitos (imagen de la izquierda).

En la imagen de la derecha, puedes ver que el eje X es CD3, el eje Y es CD4, y están representados los cuatro cuadrantes: el superior izquierdo es CD3-CD4, el inferior izquierdo es CD3-CD4-, la parte superior derecha es CD3 CD4 y la parte inferior derecha es CD3 CD4-.

Curvas de nivel y mapas de densidad

Mapas de curvas de nivel: similar a las curvas de nivel en un mapa, el número de celdas en la misma línea es igual y la curva más adentro representa el número de células.Cuanto más.

Mapa de densidad: Donde la densidad de puntos es mayor, hay más celdas, y donde la densidad de puntos es menor, hay menos celdas.

Diagrama tridimensional