Ámbito de aplicación de la citometría de flujo
Desde la década de 1970, con la mejora continua de la tecnología de citometría de flujo, su aplicación se ha generalizado cada vez más. La citometría de flujo se ha utilizado ampliamente en campos de investigación médica básica y clínica, como inmunología, hematología, oncología, biología celular, citogenética y bioquímica.
Aplicación en oncología
Esta es la primera aplicación de FCM en medicina clínica. Primero, el tejido tumoral sólido debe despolimerizarse y dispersarse para preparar una suspensión de células individuales, y luego teñirse con un tinte fluorescente (yoduro de piridinio PI) para analizar el contenido de ADN de las células y dividir el grupo indistinguible de células en tres subgrupos. (Fase G1, fase S y fase G2). El contenido de ADN representa directamente el estado de ploidía de las células y las células aneuploides están relacionadas con la malignidad de los tumores.
(1) Descubrir lesiones precancerosas y ayudar en el diagnóstico temprano de tumores: la carcinogénesis de tejidos humanos normales requiere un largo proceso desde el cambio cuantitativo hasta el cambio cualitativo. Las células precancerosas se encuentran en la etapa de transformación del cambio cuantitativo a células cancerosas. . Las células somáticas humanas normales tienen un contenido diploide de ADN relativamente estable. Cuando en el cuerpo humano se produce cáncer o lesiones precancerosas con potencial maligno, pueden producirse cambios anormales en el contenido del ADN celular durante su desarrollo. FCM puede cuantificar con precisión los cambios en el contenido de ADN y servir como un marcador valioso para diagnosticar el desarrollo de lesiones precancerosas en cáncer. También puede evaluar la naturaleza y la tendencia de desarrollo de las lesiones precancerosas, lo que es útil para el diagnóstico temprano del cáncer. Se ha confirmado que la incidencia de canceración de lesiones precancerosas está estrechamente relacionada con el grado de proliferación celular atípica. Cuanto más grave es la hiperplasia, mayor es la incidencia de cáncer. Con el agravamiento de la proliferación celular atípica, aumenta la incidencia de aneuploidía del ADN, que es un signo importante de cáncer.
(2) Papel en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de tumores: se ha reconocido el importante papel de la FCM en el diagnóstico de tumores, y la existencia de picos de células aneuploides de ADN puede proporcionar una base sólida para el diagnóstico de tumores. El análisis FCM de células patológicas tiene las ventajas de alta velocidad, gran cantidad de información y alta sensibilidad, y se ha utilizado en el trabajo diario. El análisis de ploidía del ADN de las células tumorales juega un papel importante en la determinación del pronóstico del paciente. Los tumores aneuploides tienen una alta tasa de recurrencia, tasa de metástasis y mortalidad, mientras que los tumores diploides y casi diploides tienen un mejor pronóstico.
FCM no solo puede analizar el contenido de ADN de tumores malignos, sino también evaluar la eficacia basándose en cambios en el histograma de distribución del ADN del tumor durante la quimioterapia y comprender los cambios en la dinámica celular, lo cual es de gran importancia para el tumor. quimioterapia. Los médicos pueden diseñar el mejor plan de tratamiento basado en la distribución de cada fase del ciclo celular y la teoría de la interferencia de los fármacos de quimioterapia en la dinámica celular. Pueden ver directamente los cambios en la destrucción de las células tumorales a partir del histograma del ADN y seleccionar fármacos eficaces en el momento oportuno. Lograr el máximo efecto letal sobre las células tumorales.
Además, FCM se ha aplicado al estudio de genes de apoptosis y resistencia a múltiples fármacos en los últimos años [3, 4]. Los trabajadores médicos comenzaron a estudiar cómo utilizar medicamentos para inducir la muerte de las células cancerosas. La apoptosis se analiza midiendo el volumen celular, la dispersión de la luz, el contenido de ADN y genes de antígenos específicos como bcl-2 y Fas. La resistencia a múltiples fármacos es la principal razón del fracaso de la quimioterapia en pacientes con cáncer. La determinación de la expresión de genes de resistencia a múltiples fármacos (P170, etc.), genes inhibidores de la apoptosis y genes activadores de la apoptosis proporciona una base sólida para el análisis de los efectos del tratamiento clínico.
Papel en la práctica clínica
FCM utiliza tecnología de detección de antígenos y anticuerpos fluorescentes para realizar análisis de antígenos de la superficie celular, clasificación celular y análisis de subpoblaciones. Esta tecnología juega un papel importante en la evaluación de la función inmune celular humana y en el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades sanguíneas y tumores. Una gran cantidad de artículos describen cambios en los subconjuntos de linfocitos en diversas enfermedades. La proporción de linfocitos T4/T4/T8 en personas normales es de aproximadamente 2:1, pero cuando la función inmune celular del cuerpo humano es baja, esta proporción puede invertirse. La citometría de flujo también puede controlar el rechazo renal en pacientes después de un trasplante de riñón. Si se invierte el ratio T4/T8 el paciente tiene buen pronóstico y menor rechazo renal.
Al contrario, aumenta el riesgo de rechazo. Asimismo, esta técnica analítica se utiliza para diagnosticar y tratar el VIH. Los autores también informaron valores de referencia para los inmunofenotipos de linfocitos de sangre periférica y discutieron factores que influyen como la raza, el sexo y la edad [5].
Actualmente existen más de 100 reactivos de anticuerpos monoclonales utilizados en FCM, que pueden medir y analizar los fenotipos de diversas células sanguíneas y tejidos.
Aplicaciones en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades de la sangre
El FCM se utiliza en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de diversas enfermedades de la sangre mediante la detección y análisis de antígenos de superficie y ADN de células de sangre periférica o Las células de la médula ósea juegan un papel importante.
(1) Diagnóstico y tratamiento de la leucemia: FCM utiliza varios anticuerpos monoclonales contra los antígenos de diferenciación de la superficie de las células sanguíneas (CD) para determinar una célula con la ayuda de varios tintes fluorescentes (FITC, ficoeritrina PE, etc.) varios parámetros. ) para determinar correctamente la naturaleza de las células. Cada sistema de células sanguíneas tiene sus propios antígenos únicos. Cuando el examen morfológico es difícil de diferenciar, los parámetros inmunofenotípicos juegan un papel decisivo en el diagnóstico y diagnóstico diferencial de diversas leucemias agudas [6]. Por ejemplo, las células madre expresan CD34, las células mieloides expresan CD13 y CD14, y las líneas de células B expresan CD10, CD19, CD20, etc. y líneas de células T que expresan CD2, CD3, CD5 y CD7. FCM se puede utilizar para medir los niveles de varios antígenos expresados por células hemorrágicas para ayudar en el diagnóstico clínico.
Al igual que el tratamiento de otros tumores, la determinación de la ploidía del ADN y el análisis del ciclo celular tienen un cierto papel orientador en la quimioterapia de la leucemia. Diferentes pacientes con leucemia o el mismo paciente tienen diferentes condiciones de proliferación de células leucémicas en diferentes etapas. Por lo tanto, la comprensión regular de la proliferación celular y la toma de los medicamentos correspondientes pueden mejorar la eficacia.
En la actualidad, además de la quimioterapia, el trasplante de células madre hematopoyéticas también se utiliza para tratar la leucemia aguda y algunas enfermedades difíciles [7]. FCM puede seleccionar el donante más adecuado para pacientes con trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas determinando la compatibilidad HLA. La tecnología de trasplante de células madre hematopoyéticas incluye principalmente una serie de procesos como la identificación de células madre, medición de la actividad, movilización y recolección de células madre, aislamiento y purificación, almacenamiento y expansión, purificación de células tumorales, reinfusión de células madre y mantenimiento de una baja incidencia de injertos. Enfermedad versus huésped después de la cirugía. La medición por citometría de flujo de marcadores de la superficie celular como CD34, HLA-DR y CD33 se ha convertido en una importante herramienta de seguimiento para el trasplante de células madre. El uso de FCM para detectar una serie de indicadores para observar el estado de recuperación del paciente puede emitir juicios tempranos sobre el pronóstico.
(2) Diagnóstico, tratamiento y seguimiento de otras enfermedades de la sangre: La hemoglobinuria paroxística nocturna es una enfermedad clonal de las células madre hematopoyéticas, y se caracteriza por una expresión reducida de los antígenos CD55 y CD59 intracelulares. Este antígeno pertenece a la familia de proteínas ancladas al fosfatidilinositol en la superficie de las células sanguíneas y es una importante proteína reguladora del complemento. Puede prevenir la formación del complejo de ataque a la membrana del complemento uniéndose al complemento C8 y C9, inhibiendo así la lisis de las células activadas por el complemento. FCM utiliza anticuerpos monoclonales fluorescentes para analizar cuantitativamente la expresión de CD59 en las células sanguíneas, lo que puede ayudar al diagnóstico clínico y determinar la gravedad de la enfermedad [8].
(3) Determinación y aplicación clínica de los reticulocitos: el recuento de reticulocitos es un indicador importante que refleja la función hematopoyética de la médula ósea. El FCM combinado con algunos tintes fluorescentes (naranja de acridina, naranja de tiazol, etc.) puede medir cuantitativamente el ARN en los reticulocitos. ), y obtener el porcentaje de reticulocitos en los glóbulos rojos maduros. Algunos autores informaron que el método FCM es más preciso que la inspección visual [9]. Además, la FCM también puede medir la madurez de los reticulocitos, lo cual es de gran importancia para juzgar la capacidad de proliferación de los glóbulos rojos [10]. Proporciona una base para juzgar la recuperación después del trasplante de células madre, monitorear el tratamiento de la anemia y la supresión de la médula ósea en pacientes con cáncer mediante radioterapia y quimioterapia.
Aplicación en trombosis y enfermedades hemorrágicas
(1) Determinación de la función plaquetaria: En circunstancias normales, las plaquetas corren en estado disperso en los vasos sanguíneos, pero cuando los vasos sanguíneos están dañados, cuando El flujo sanguíneo cambia o es estimulado por sustancias químicas, las plaquetas se activan y sufren una serie de cambios. Dado que el grado de activación plaquetaria puede juzgarse por el nivel de expresión de la glicoproteína de la membrana plaquetaria, la medición por FCM de la expresión de la glicoproteína de la membrana plaquetaria se ha convertido en un nuevo método para examinar la función plaquetaria [11]. El método es sensible y específico.
Si se utiliza el método de sangre total, sólo se requiere una pequeña cantidad de muestra, que es adecuada para niños y pacientes con trombocitopenia [12]. Cuando las plaquetas se activan, las glicoproteínas de su membrana plasmática sufren cambios significativos en comparación con su estado de reposo. FCM puede monitorear la función y activación plaquetaria a través de tecnología de inmunofluorescencia de anticuerpos monoclonales (glucoproteína de membrana plaquetaria ⅱb/ⅲa, CD62, CD63, etc.). ), que es beneficioso para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades tromboembólicas.
Además, cuando las plaquetas se activan, la concentración de iones calcio intracelular cambia mucho. Con la ayuda de sondas fluorescentes sensibles a los iones de calcio, el FCM se puede utilizar como indicador no inmunológico para controlar las plaquetas activadas. (2) Determinación de anticuerpos relacionados con las plaquetas: los autoanticuerpos plaquetarios se pueden producir en el plasma de pacientes con púrpura trombocitopénica inmunitaria y se unen a la superficie de las plaquetas, que se denominan anticuerpos relacionados con las plaquetas. Sus moléculas pueden ser IgG, IgA o IgM. Las plaquetas se marcan con anticuerpos fluorescentes IgG, IgA e IgM antihumanos de cabra, y el FCM puede determinar el contenido de anticuerpos relacionados con las plaquetas. El método directo puede detectar anticuerpos relevantes en la superficie de las plaquetas y el método indirecto puede detectar anticuerpos relevantes en el suero. Este método se utiliza para el diagnóstico de enfermedades y el seguimiento del tratamiento y tiene las ventajas de una velocidad de detección rápida y una alta sensibilidad.
Gestión de calidad
1. Calibración del citómetro de flujo
La calibración del citómetro de flujo incluye la estabilidad de la ruta del flujo, la estabilidad de la ruta óptica. y compensación múltiple de fluorescencia marcada en color, linealidad y estabilidad de la conversión del tubo fotomultiplicador. La calibración del instrumento utiliza principalmente microesferas estándar para el monitoreo. El poliestireno se puede convertir en microesferas de varios tamaños y también se puede marcar con fluorescencia o tener sitios de unión para inmunoglobulinas cuantitativas. Las microesferas de poliestireno con intensidad de fluorescencia, tamaño y dispersión de luz fijos se han convertido en un estándar universal en el control de calidad del flujo.
2. Control de calidad del proceso de operación experimental
1. Control de calidad de las muestras
Existen muchos tipos de muestras utilizadas para el análisis de flujo, incluidas las de sangre periférica y líquido de aspiración de médula ósea, biopsia de médula ósea, biopsia de tejido, derrame seroso, líquido cefalorraquídeo, piel, mucosas (biopsia endoscópica), biopsia con aguja fina, etc. El control del estado de las muestras puede ser uno de los aspectos más difíciles del control de calidad en el análisis de inmunofenotipado. Cada muestra tiene diferentes requisitos de recolección, almacenamiento, transporte y preparación. 1. Observar la apariencia de la muestra: Las muestras con hemólisis, coagulación o necrosis severa deben desecharse.
En segundo lugar, la adquisición de una suspensión unicelular: la sangre periférica y el líquido de aspiración de médula ósea son suspensiones unicelulares naturales; la separación mecánica y la digestión enzimática se utilizan a menudo para la biopsia de tejido. Diferentes experimentos requieren la aplicación de diferentes métodos. Para el etiquetado de antígenos de membrana, no sólo es necesario obtener suficiente suspensión de células individuales, sino también garantizar la integridad y antigenicidad de la estructura celular tanto como sea posible. Los métodos mecánicos son más adecuados. Si solo se requiere análisis del ciclo celular o de la ploidía del ADN, es más apropiado agregar digestión enzimática (como tripsina y pepsina) al método mecánico.
En tercer lugar, la elección del anticoagulante: las muestras de sangre periférica se pueden anticoagular con EDTA, ACD o heparina. Si se usa la misma muestra de sangre para el recuento de glóbulos blancos y el análisis de flujo, use EDTA para la anticoagulación para experimentos de análisis de plaquetas; la heparina generalmente no se usa para la anticoagulación; La heparina o EDTA se utilizan comúnmente para la anticoagulación en el líquido de aspiración de médula ósea. Debido a que cantidades relativamente grandes de ACD pueden afectar la viabilidad de las células de la médula ósea al cambiar el pH, generalmente no se recomienda la ACD como anticoagulante en aspirados de médula ósea.
4. Preservación de las muestras: Lo ideal es que las muestras se procesen y tiñan inmediatamente después de su recogida. La sangre y la médula ósea anticoaguladas con heparina generalmente se pueden almacenar durante 48-72 horas/temperatura ambiente (16-25) la sangre periférica y la médula ósea anticoaguladas con EDTA se pueden almacenar durante 12-24 horas/temperatura ambiente (16-25); La sangre periférica se puede almacenar durante 72 horas/temperatura ambiente (16-25). Para las muestras que se tiñen solo en las células, las células se pueden fijar para un almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, este enfoque de “tinción fija” depende de las propiedades del antígeno que se va a analizar y del método de tinción.
5. Métodos para eliminar glóbulos rojos: el método de lisis de glóbulos rojos es simple y rápido de operar, y es más probable que mantenga la distribución de glóbulos blancos en la muestra original. Lo mejor es hemolizar después de teñir.
Si se produce hemólisis antes de la tinción, se debe confirmar que: (1) la antigenicidad no cambia debido al proceso de hemólisis (2) el agente hemolítico se elimina por completo y la reacción cinética de unión célula-anticuerpo no se ve afectada; (3) el agente hemolítico utilizado no se ve afectado. Contiene fijador; de lo contrario, afectará la viabilidad celular y los resultados del etiquetado de la superficie. Mediante la centrifugación en gradiente de densidad, las células diana pueden recuperarse bien y posiblemente enriquecerse mientras se eliminan los glóbulos rojos y los desechos, pero lleva mucho tiempo y puede perder selectivamente algunas poblaciones de células importantes.
6. Proporción de células a anticuerpos: la dosis de anticuerpos recomendada por el fabricante generalmente supone que la cantidad de células objetivo está en el rango de 5X105 ~1x106. Algunas muestras no tienen suficientes células, mientras que otras tienen una gran cantidad de células y un exceso o deficiencia relativa de anticuerpos en concentraciones normales, lo que da como resultado resultados falsos positivos o falsos negativos. Por lo tanto, cada laboratorio debe ajustar la dosis de células y anticuerpos según métodos diferentes a los recomendados por el fabricante para obtener una relación célula/anticuerpo óptima.
Séptimo, identificación de la actividad celular: las células muertas tienen una fuerte tinción no específica para muchos anticuerpos, lo que hace que sea muy importante detectar la actividad celular de las muestras, especialmente aquellas que han sido transportadas y almacenadas durante un largo tiempo. muestra de tiempo. Generalmente existen dos métodos de detección: (1) Detección de flujo en tiempo real: las células muertas se tiñen con colorantes fluorescentes yoduro de piridinio (PI), 7-aminoactinomicina D (7-AAD) o EMA (las células rechazan la tinción con estos). tintes. La ventaja de este enfoque es que el etiquetado de la superficie celular y el análisis de actividad se pueden realizar simultáneamente. Especialmente indicado para muestras altamente necróticas. El más utilizado es el 7-AAD, porque su luz de emisión máxima es de aproximadamente 670 nm con excitación de 488 nm y es adecuado para etiquetado multicolor con FITC o PE. Pero con el tiempo, 7AAD se redistribuye dentro de una población fija de células, lo que dificulta distinguir entre células vivas y muertas. Por lo tanto, para muestras teñidas y analizadas más de 12 horas después de la fijación, es mejor utilizar EMA. La combinación de valencia estable de EMA y ADN de células muertas garantiza que después de una fijación prolongada, se pueda distinguir bien el estado de vida y muerte antes de la fijación. (2) Detección manual: utilice azul tripán u otros colorantes de viabilidad celular. (3) Utilice instrumentos especiales para las pruebas. Por ejemplo Vi-cell.
2. Seleccionar y determinar una combinación de anticuerpos monoclonales.
El reactivo más básico para el análisis de flujo son los anticuerpos. La calidad del anticuerpo elegido afecta directamente a los resultados. Hay muchos factores que afectan las características de los anticuerpos, como la relación F/P, la isoforma, la longitud completa o el fragmento, la fuente de la semilla, el tipo fluorescente marcado, etc. Además, existen más de 300 tipos de anticuerpos monoclonales con números de clasificación de CD, y también hay una gran cantidad de anticuerpos monoclonales sin números de clasificación de CD, lo que dificulta aún más la selección de anticuerpos. En términos generales, la selección de combinaciones de anticuerpos sigue los siguientes principios básicos: 1) La combinación de anticuerpos seleccionada debe ser lo suficientemente amplia como para identificar todas las subpoblaciones celulares de la muestra, incluidas las poblaciones normales y anormales. 2) Para antígenos con baja expresión, se deben seleccionar en la medida de lo posible marcadores de fluoresceína con una fuerte intensidad de fluorescencia. 3) Comprender el espectro de respuesta celular y los patrones de tinción de diferentes anticuerpos. Elija anticuerpos en función de diferentes propósitos experimentales. Porque los anticuerpos con el mismo número de CD pueden reconocer epítopos diferentes. 4) Varias combinaciones de anticuerpos pueden afectar la unión de los antígenos entre sí (por ejemplo, a través del impedimento de la configuración espacial). Por lo tanto, para la combinación de anticuerpos utilizada, primero es necesario conocer la expresión de la etiqueta de un solo color de cada uno. anticuerpo en células de control. 5) Los experimentos clínicos deben utilizar reactivos de diagnóstico in vitro (IVD) y reactivos de especificidad analítica (ASR) tanto como sea posible, mientras que los reactivos específicos de investigación (RUO) generalmente no se pueden utilizar en experimentos de diagnóstico in vitro. En China, los reactivos utilizados para diagnósticos in vitro también deben obtener la certificación nacional SDA. De esta manera, los anticuerpos en una combinación de anticuerpos pueden provenir de diferentes compañías, con diferentes concentraciones, diferentes subtipos y diferentes valores de F/P. Es posible que todos necesiten sus propios controles de isotipo, pero en realidad esto es difícil. Luego, intente elegir reactivos de la misma empresa para reducir las interferencias anteriores. Para proyectos clínicos comunes de detección de flujo, las combinaciones de reactivos requeridas básicamente tienen combinaciones de anticuerpos de referencia o recomendadas.
Por ejemplo, detección de subconjuntos de células T de CD45/CD4/CD8/CD3, CD45/CD56/CD 19/CD3; CD55 y CD59 mediante detección de hemoglobinuria paroxística (PNH);
Pero hasta ahora no existe en el mundo una combinación unificada de anticuerpos para la inmunotipificación de leucemia/linfoma. En 2000, la Sociedad Internacional para el Análisis de Células (ISAC) convocó una reunión internacional de expertos organizada por la Sociedad para el Conteo Clínico de Sangre para desarrollar una comprensión de las cantidades mínimas y más efectivas de anticuerpos monoclonales necesarias para la detección de neoplasias hematológicas y linfoides. . El 75% de los participantes coincidió en que existen 9 tipos de anticuerpos monoclonales contra la enfermedad linfoproliferativa crónica (EPC): CD5, CD19, κ, λ, CD3, CD20, CD23, CD10 y CD45 es el más básico para el diagnóstico inicial. El linfoma es similar a la EPC y requiere al menos de 12 a 16 anticuerpos monoclonales. Para la leucemia aguda (AL), el 75% de los participantes consideró esenciales aproximadamente entre 13 y 15 anticuerpos monoclonales: CD10, CD19, CD79A, CD13, CD33, CD34, CD45, Cd2 y MPO. Otros (CD16, CD56, CDW65, TDT, CYCD 3) pueden resultar útiles en algunos casos. Casi todos los votantes estuvieron de acuerdo en que el número adecuado de anticuerpos monoclonales necesarios para completar la clasificación de las leucemias agudas era, en promedio, de 20 a 24. Sin embargo, la combinación de estos anticuerpos también es un gran problema y actualmente no existe una regulación unificada (ver Tabla 2). La mayoría de los oradores (11/13) señalaron que sólo se necesitan unos pocos mAb para monitorear y estadificar a los pacientes ya diagnosticados.
El control de calidad de los anticuerpos es una parte clave del experimento. Las cualidades de los anticuerpos incluyen especificidad, sensibilidad y precisión. En respuesta a esto, algunas empresas comerciales han lanzado una serie de productos de control de calidad para la inspección de anticuerpos monoclonales de uso común. Por ejemplo, Cyto-Trol e Immuno-Trol de Beckman Coulter (ver Tabla 1).
3. Método de tinción
Tinción de la superficie celular: este método se utiliza para la mayoría de los análisis de inmunofenotipado. Sin embargo, dado que también existen muchos antígenos en las células al mismo tiempo, se debe prestar especial atención al mantenimiento de la integridad de la membrana celular para garantizar la especificidad de la prueba. Los marcadores de superficie se pueden dividir en marcadores prehemolíticos y marcadores poshemolíticos. Si los glóbulos rojos o los componentes del plasma afectan el etiquetado, es adecuado para el etiquetado después de la hemólisis. Sin embargo, se debe prestar atención a la influencia del antígeno de membrana del agente hemolítico, por lo que el agente hemolítico generalmente no contiene un fijador. Los ejemplos incluyen pruebas de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y pruebas de hemoglobinuria paroxística.
Tinción intracelular: La detección de determinados antígenos intracelulares es especialmente importante para el inmunofenotipado de la leucemia, como TDT, MPO, CCD 3, CCD 79 A, etc. La clave de la tinción intracelular es permeabilizar el tejido. membrana celular, introduciendo anticuerpos o colorantes de ácidos nucleicos en las células sin afectar la integridad del citoesqueleto. También es necesario garantizar que los pasos de inmovilización y permeabilidad de la membrana no afecten la capacidad de unión de los antígenos relevantes y los anticuerpos correspondientes ni la capacidad de unión de los ácidos nucleicos y colorantes. Algunos reactivos adecuados para la tinción intracelular pueden no serlo para el análisis de marcadores de superficie. Generalmente, la tinción intracelular no se puede realizar simultáneamente con la detección de la viabilidad celular a menos que se utilice el método EMA. Para la tinción intracelular, la fluoresceína utilizada debe ser lo suficientemente pequeña como para penetrar la membrana celular. Algunos tintes de ácidos nucleicos (como TO, AO, etc.) son tintes de células vivas y no requieren fijación ni permeabilidad de la membrana.
Tinción de membrana celular e intracelular: habitualmente tinción de membrana celular, fijación, permeabilidad de membrana y tinción intracelular, y finalmente tinción de ADN.
Tres. Adquisición y análisis de datos
La adquisición de datos del citómetro de flujo debe basarse en la calibración del rendimiento del instrumento. Debido a que el citómetro de flujo se basa en el análisis de señales de luz dispersa y señales de fluorescencia, los ajustes del voltaje, ganancia, compensación de color y otros parámetros del tubo fotomultiplicador de las señales de luz dispersa y de fluorescencia del instrumento afectan directamente los resultados. Es especialmente importante establecer un control homogéneo. Un control de isotipo es una inmunoglobulina de un animal no inmune que tiene la misma fuente, isotipo y etiqueta de fluoresceína que el anticuerpo monoclonal. Al mismo tiempo, la concentración y el valor F/P deben ser lo más idénticos posible, para que la definición del umbral positivo sea más precisa, especialmente para la determinación de la tasa positiva de antígenos débilmente expresados. La configuración del material de referencia en el análisis de ploidía del ADN es muy importante. Los glóbulos rojos de pollo se utilizan generalmente como material de referencia interno. Para que los resultados sean fiables, el número de células obtenidas debe ser de al menos 10.000-20.000.
Sin embargo, los diferentes propósitos experimentales generalmente tienen diferentes requisitos para el número de células obtenidas. Por ejemplo, para el análisis de ploidía del ADN, se deben obtener al menos 10.000 células para la detección de enfermedad residual mínima (ERM), si se requiere un nivel de 10-4; , se deben analizar al menos 100.000 células para la detección de CD34 en el trasplante de células madre, y se deben obtener al menos 100 células CD34 positivas o 75.000 células nucleadas.
Los datos obtenidos deben guardarse en el archivo listmode para facilitar el análisis. La activación es muy importante para el análisis de datos de transmisión. Configurar la puerta es en realidad determinar el área de análisis. En el análisis de ploidía del ADN, la activación en realidad rodea células individuales y excluye las células adherentes. Para muestras con componentes unicelulares (como células cultivadas), configurar puertas es relativamente sencillo. Pero para muestras con composición compleja (como la médula ósea), no es tan sencillo establecer la puerta con precisión. Hay muchos factores de interferencia en la activación de la luz dispersada hacia adelante (FS) y la luz dispersada lateral (SS). Actualmente, cada vez más se están reemplazando por marcadores inmunológicos y puertas de luz dispersa. Por ejemplo, la activación de CD45/SS se ha convertido en el mejor método de activación para el inmunofenotipado de leucemia/linfoma, la detección de CD34 y la monitorización de ERM. La activación de CD19/SS es muy adecuada para el análisis de enfermedades linfoproliferativas B maduras.
En el análisis de datos, el porcentaje, la intensidad de fluorescencia, el índice de ADN (DI) y la cantidad/ul se utilizan comúnmente en nuestros informes. El porcentaje es útil principalmente para cambios cuantitativos en los indicadores de inspección que se centran en la presencia o ausencia de celdas. Como la detección de subpoblaciones de células T, detección de reticulocitos, etc. La intensidad de la fluorescencia se utiliza principalmente para detectar la cantidad de antígeno en las células. Como la detección de debilidad plaquetaria (GT) y cambios de CD20 en la leucemia linfocítica crónica (LLC). DI se utiliza para el análisis de ploidía del ADN. Cuantificación absoluta de CD4 en sangre periférica, CD3 en seguimiento del tratamiento con OKT3, CD34 en trasplante de células madre, etc. En la clasificación del SIDA, finalmente se expresa en forma de concentración/ul. El análisis de los resultados inmunofenotípicos de leucemia/linfoma se informa a la clínica en forma de porcentajes, pero los resultados porcentuales simples no pueden reflejar completamente las características de las células tumorales. Debido a que el estándar de juicio positivo artificial de 20 ignora los resultados positivos débiles por debajo de 20, ignora la diferencia en la intensidad de la fluorescencia entre los resultados positivos, que son muy importantes para el diagnóstico y clasificación de la leucemia/linfoma. En la actualidad, la mayoría de los métodos para informar la presencia e intensidad de antígenos se recomiendan con palabras y se abandona el método de informe de porcentajes.
IV.Evaluación de la calidad del proceso de pruebas y análisis clínicos
El control de calidad también debe prestar atención a la selección y evaluación de los métodos de prueba. Cualquier experimento seguramente tendrá errores. En cierto sentido, los errores pueden dividirse en errores sistemáticos de metodología experimental y errores aleatorios más allá de eso. Los métodos y medios de control de calidad sólo pueden reducir o eliminar errores aleatorios sin afectar los errores sistemáticos. Para controlar el error de los resultados de la prueba a un nivel bajo clínicamente aceptable o dentro del rango de error permitido, se deben utilizar métodos de prueba (incluidos instrumentos, reactivos, métodos operativos específicos, etc.) para cumplir con los requisitos clínicos para garantizar que el Los resultados de las pruebas cumplen con los requisitos clínicos de control de calidad. El propósito del control de calidad del laboratorio clínico es utilizar métodos apropiados para alertar a los analistas cuando ocurren errores importantes durante los experimentos de monitoreo. En términos generales, la forma de comprobar la calidad de los resultados experimentales es identificar materiales de control de calidad. El método más común es la inspección de rutina de los materiales y pacientes de control de calidad. Para comprender la calidad de la inspección, es necesario dibujar los resultados de la medición de la sustancia de control de calidad en el cuadro de control y observar si los resultados del control exceden el límite de control para determinar si está fuera de control.
Durante el primer mes de uso de materiales de control de calidad, los inspectores insertan aleatoriamente materiales de control de calidad en muestras de pacientes todos los días para determinar los elementos de prueba. Al final del mes, haga estadísticas simples sobre los resultados de las mediciones (n ≥ 20) de ese mes y calcule la media x y la desviación estándar s. Si la distribución de los resultados de la prueba se acerca a una distribución normal, la media y. La desviación estándar se puede utilizar para describir la distribución de los resultados de la prueba. Esto significa que el resultado de 95,5 está dentro de x 2 s y el resultado de 99,7 está dentro de x 3 s. Para observar los resultados del control de calidad y comprender las condiciones de falla de manera oportuna, a menudo se utilizan gráficos de control de calidad.
De acuerdo con la ley de distribución normal: 1) Todos los valores medidos deben distribuirse uniformemente en ambos lados de la media y no debe haber una sensación obvia de desigualdad 2) El valor medido de calidad; el producto de control 95.5 debe estar dentro del rango de x 2s ;3) No debe haber resultados que caigan en un lado del promedio por más de 6 veces consecutivas 4) No debe haber un aumento o disminución gradual en los resultados por más de 6 veces; 5 veces consecutivas; 5) No debe haber dos resultados consecutivos en x 2s Fuera del rango 6) No hay ningún resultado más allá del rango de x 3s;
Si no se siguen las reglas anteriores, el resultado estará fuera de control. Sólo cuando se confirme que los resultados del control de calidad del día están bajo control se podrán emitir los resultados del examen clínico del día. Una vez fuera de control, descubra la causa y vuelva a comprobarlo. Se dará una advertencia por 1 resultado de prueba que exceda el rango de ±2 desviaciones estándar de la media. Los resultados de dos productos de control de calidad en el mismo lote de experimentos difirieron en más de 4 segundos, lo que también es una de las reglas fuera de control, lo que indica la existencia de errores aleatorios. Cuatro resultados de control de calidad consecutivos en la misma dirección exceden el rango de 1 desviación estándar, que también es uno de los patrones fuera de control, lo que indica la existencia de errores sistemáticos.
5. Evaluación de la calidad de la sala
Realizar un control de calidad interno para garantizar que los elementos de control experimental alcancen una cierta precisión. La práctica clínica a menudo sólo es sensible a si los resultados experimentales son reproducibles. Si hay errores sistemáticos estables en los resultados experimentales, generalmente no es fácil detectarlos en entornos clínicos y de laboratorio, por lo que el control de calidad interno tiene como objetivo controlar la inexactitud de los resultados. Agencias especializadas distribuyen periódicamente materiales de control de calidad a los laboratorios clínicos, y cada unidad debe devolver los resultados de las pruebas después de las mismas. Después de la clasificación y las estadísticas, las diferencias entre laboratorios y métodos analíticos se reflejan en forma de datos e informes. Con base en el grado de dispersión entre los resultados de las pruebas de cada unidad y el valor objetivo, se calcula la puntuación de este laboratorio y se brinda retroalimentación oportuna a los participantes para facilitar la mejora. Esta es la forma básica de evaluación de la calidad interior. La evaluación de la calidad del laboratorio tiene como objetivo principal controlar la inexactitud del trabajo de laboratorio y es un complemento del control de calidad interior. En 2000, el Centro de Laboratorio Clínico del Ministerio de Salud comenzó a organizar la evaluación de la calidad de los citómetros de flujo clínicos en mi país. Se ha realizado la detección de subconjuntos de células T y la evaluación intersticial ventricular de los recuentos absolutos de CD34.