Cómo eliminar sustancias que inhiben la amplificación por PCR de la sangre completa
Inhibidores de la PCR: factores que inhiben o interfieren con la reacción de la PCR, como algunos iones metálicos, disolventes orgánicos como fenol, cloroformo, etc., y sustancias como las proteasas.
La forma habitual de eliminar inhibidores es diluir la muestra. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, la concentración de inhibidores es alta y la cantidad de plantilla es pequeña. El método de dilución ya no puede lograr buenos resultados, pero hará que la reacción sea más sensible. La temperatura disminuye, por lo que si los investigadores quieren realizar investigaciones de PCR cuantitativa en tiempo real, lo mejor es utilizar plantillas purificadas. La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utiliza ADN para desenrollarse a 95 grados centígrados in vitro y a 55 grados centígrados. -hebradas Se combina el principio del emparejamiento de bases complementarias y luego la temperatura se ajusta a aproximadamente 72 grados. La ADN polimerasa sintetiza hebras complementarias a lo largo de la dirección del fosfato al azúcar de cinco carbonos (5'-3'). mediante la tecnología PCR es en realidad un control de temperatura. El equipo se puede controlar bien entre 95 grados, 55 grados y 72 grados.
El principio básico de la tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su La especificidad depende de ambos extremos de la secuencia objetivo. Los cebadores de oligonucleótidos complementarios. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización - hibridación - extensión: ① Desnaturalización del ADN molde: después de que el ADN molde se calienta a aproximadamente 93 ° C durante un cierto período de tiempo. tiempo, el ADN molde es bicatenario o PCR. El ADN bicatenario formado por amplificación se disocia y se convierte en una sola hebra para que pueda unirse al cebador y prepararse para la siguiente ronda de reacción ② Recocido (renaturalización) de; ADN molde y cebador: después de calentar y desnaturalizar el ADN molde en una sola cadena, la temperatura desciende a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria de la cadena simple del ADN molde ③ Extensión del cebador: molde de ADN-cebador; La combinación utiliza dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo como plantilla bajo la acción de la ADN polimerasa Taq. De acuerdo con el principio de emparejamiento complementario de bases y replicación semiconservativa, se crea una nueva cadena de replicación semiconservadora complementaria a la cadena de ADN plantilla. Se sintetiza y se pueden obtener más "cadenas de replicación de semiconservación" repitiendo los tres procesos de desnaturalización-recocido-extensión, y esta nueva cadena puede convertirse en una plantilla para el siguiente ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar cada ciclo. , y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar millones de veces en 3 horas.