Cómo eliminar los efectos de las sustancias que contienen N no proteicas
El siguiente experimento 5 está bien: el resto te puede ser útil, por eso no los he eliminado
Experimento 1: Aislamiento y extracción de polifenol oxidasa (PPO)
1. Principio y propósito
La polifenol oxidasa es una oxidasa que contiene cobre ampliamente presente en los tejidos de las plantas después de que la planta es dañada mecánicamente e infectada por patógenos, la PPO cataliza la oxidación de fenol y O2 a. Forman quinona, que es la forma en que los tejidos se oscurecen para facilitar la recuperación de daños, prevenir o reducir infecciones y mejorar la resistencia a enfermedades. Las quinonas son tóxicas para los microorganismos, por lo que la aparición de quinonas en las heridas es una reacción callosa de las plantas para prevenir la infección de las heridas. Por lo tanto, la actividad de esta enzima en los tejidos lesionados generalmente aumentará. La polifenol oxidasa también se puede acoplar con la oxidación de otros sustratos intracelulares para funcionar como una oxidasa terminal.
La presencia de PPO es una de las principales causas del pardeamiento y pérdida de nutrientes en frutas y verduras. La PPO oxida sustancias fenólicas endógenas para generar o-quinonas, y las o-quinonas luego se polimerizan entre sí para formar quinonas o proteínas, aminoácidos, etc. para formar complejos poliméricos, lo que da como resultado la formación de pigmentos marrones cuanto mayor es el peso molecular de. cuanto más pigmento, más oscuro es el color. La actividad de la polifenol oxidasa es también uno de los indicadores de la liberación del letargo de la papa.
Este experimento utilizará patatas como material principal y obtendrá la solución enzimática cruda de PPO mediante trituración y homogeneización de células de tejido, filtración, centrifugación, precipitación con sulfato de amonio, diálisis y otros pasos.
A través de este experimento, los estudiantes aprenderán y comprenderán los principios y métodos básicos de extracción y separación de proteínas, dominarán la operación y el uso de instrumentos y equipos relevantes, y la tecnología del sistema de extracción y separación de proteínas.
2. Materiales y reactivos
(1) Patatas (unos 100-200 g por grupo)
(2) Reactivos:
Se prepara tampón de fosfato 0,03 M pH 6,0 (que contiene mercaptoetanol 0,02 M, MEDTA 0,001, 5 % de glicerol, polivinilpirrolidona al 1 %) con 1000 ml de solución concentrada x10 veces de sulfato de amonio sólido 0,03 M pH 6,0 (contiene 0,02 M; mercaptoetanol, 0,001 MEDTA, 0,005 MgCL2) cuando esté configurado
(3) Instrumentos y equipos experimentales:
Tubos de ensayo y soportes para tubos de ensayo, varilla agitadora de vidrio, gotero, etc. .; botella de reactivo; bolsa de diálisis;
Gasa filtrante; homogeneizador de tejido vegetal; medidor de pH y papel de prueba de pH; centrífuga refrigerada de alta velocidad;
p>
Centrífuga refrigerada de gran capacidad y baja velocidad DL-7A
3. Pasos de operación
1: Extracción de enzima cruda:
Prensa de tejido de pulpa de fruta 1: 1 ( (p/v) se mezcla con tampón fosfato 003 M PH6.0 (que contiene mercaptoetanol 0,02 M, MEDTA 0,001, 5 % de glicerina, 1 % de polivinilpirrolidona), se homogeneiza en 4 capas y luego se filtra con una gasa y el filtrado se gira a 6000 rpm en una centrífuga. durante 10 minutos y desechar el precipitado para obtener extracto enzimático.
2: Salado y precipitación fraccionada:
Agregue sulfato de amonio sólido al extracto enzimático hasta alcanzar el 40% de saturación (revuelva mientras agrega para disolver completamente) y luego centrifugue a 6000 rpm. Deseche el precipitado después de 20 minutos; agregue sulfato de amonio sólido al sobrenadante centrifugado hasta alcanzar el 70% de saturación (agite mientras agrega para disolver completamente), luego centrifugue a 6000 rpm durante 20 minutos, deseche el sobrenadante y recoja el precipitado enzimático crudo.
IV.Resultados experimentales
Obtener solución enzimática cruda de PPO.
Experimento 2 Purificación de la solución de enzima cruda PPO
1. Principio
1. La cromatografía en columna de gel Sephadex G-200 utiliza moléculas grandes que no pueden ingresar al interior de la misma. Las partículas de gel salen primero de la columna, mientras que las sustancias de moléculas pequeñas ingresan al interior de las partículas de gel con un caudal lento y finalmente salen de la columna. La cromatografía en gel puede separar sustancias de diferentes tamaños moleculares. (G-200 puede separar proteínas con un peso molecular de 800-80000D)
2. Utilice el método de intercambio iónico para seleccionar el material de la columna DE52 de celulosa aniónica DEAE, porque la PPO es una proteína con cationes y durante. cromatografía Se adsorberá en el material de la columna y las proteínas impurezas se eliminarán por lavado. Luego use un gradiente de NaCl para eluir la PPO (NaCl es un intercambiador de iones fuerte y puede desplazar la PPO débilmente adsorbida en el material de la columna). De este modo se purificó la solución enzimática bruta.
2. Materiales y reactivos
Reactivo: tampón Tris-HCL 0,02 M Ph7.4 (que contiene EDTA 0,001 M) al preparar ×10 veces solución concentrada 1000 ml; DEAE-celulosa DE52; Sephadex G-200; Glucosa-40, 70, 100, etc.;
Instrumentos y equipos experimentales: tubos de ensayo, soportes para tubos de ensayo, vasos de precipitados, varilla agitadora de vidrio, pipeta, gotero, etc., botellas de reactivos, columnas de cromatografía, medidor de pH y papel de prueba de pH, bomba de flujo constante, mezclador de gradiente, monitor de proteínas de ácido nucleico, centrífuga refrigerada de alta velocidad GL-20C, centrífuga refrigerada de baja velocidad y gran capacidad DL-7A; p>
3. Pasos de operación
1. Procesamiento, empaquetamiento de la columna y equilibrio del gel de dextrano
(1) Procesamiento del material de la columna
Pesar una cierta cantidad de polvo seco de Sephadex G-200, agregar agua desionizada o agua destilada y remojarlo Hinche durante 48 horas y elimine las partículas finas suspendidas. Para evitar la presencia de aire en las partículas de gel y afectar el efecto de la cromatografía, el gas en el líquido del gel debe eliminarse antes de cargar el gel en la columna. Coloque el gel líquido en la botella de filtro y realice un tratamiento de vacío hasta que no aparezcan burbujas en la solución de gel.
(2) Embalaje de la columna
Limpiar la columna de cromatografía y fijarla verticalmente en el soporte de cromatografía. Añadir 1/3 del volumen de agua desionizada, abrir la salida inferior y dejar fluir. flujo de agua Vierta inmediatamente la concentración adecuada de solución de gel en un vaso de precipitados pequeño (una concentración demasiado alta del gel producirá burbujas, lo que afectará la velocidad de separación de proteínas, y si la concentración es demasiado baja, fácilmente causará la estratificación del gel, lo que afectará el efecto de separación de proteínas) en la columna de cromatografía. El gel se asentará de forma natural y lenta en el fondo de la columna de cromatografía. Deje de cargar. de la columna. Cortar un trozo de papel de filtro igual al diámetro interior de la columna y cubrirlo con el gel. La entrada de líquido en el extremo superior de la columna de cromatografía está conectada a la bomba de flujo constante y la salida de líquido inferior está conectada al monitor de proteínas hasta que la columna de cromatografía esté equilibrada.
(3) Balanza
La columna de cromatografía debe equilibrarse antes de cargar la muestra para la cromatografía en columna. La llamada balanza significa que la solución en la columna de cromatografía se mezcla con el tampón. del proceso de cromatografía (eluyente) se reemplaza para que el sistema tampón en la columna de cromatografía sea consistente con el sistema durante la cromatografía en columna. El método es: use la bomba de flujo constante en el extremo superior de la columna de cromatografía para bombear el tampón de equilibrio a la columna de cromatografía, abra la salida en el extremo inferior de la columna de cromatografía, el caudal del líquido de equilibrio es 0,5-1 ml /min, y el valor de pH del efluente de salida es La columna alcanza el equilibrio cuando el pH del tampón de equilibrio es constante. En este experimento, el gel Sephadex G-200 se equilibró con tampón Tris-HCL 0,002 M, pH 7,4 (que contenía EDTA 0,0001 M).
2. Carga: Cargue la solución enzimática cruda en la columna.
3. Elución: Eluir con tampón Tris-HCL Ph7.4 0,02 M (que contiene EDTA 0,001 M) y recoger el eluido para el análisis de propiedades básicas y la determinación de la actividad enzimática, la concentración de proteínas y el peso molecular de la electroforesis en gel de poliacrilamida.
4. Tratamiento y relleno de columna de DEAE-celulosa
(1) Tratamiento
Este experimento utiliza DEAE-celulosa DE 52, que es un intercambiador de aniones débilmente ácido. El método de tratamiento específico es: Primero. , remoje el polvo seco del intercambiador aniónico DE52 en agua destilada para eliminar las impurezas, luego sumérjalo en una solución de HCL 0,5 N durante 1 a 2 horas, luego lávelo con agua desionizada o agua destilada hasta que el valor de pH sea neutro o superior a PH4 y bombee; Escúrralo en el embudo del filtro; remoje el intercambiador de iones seco en una solución de NaOH 0,5 N durante 1 a 2 horas y luego lávelo con agua desionizada o agua destilada hasta que esté neutro.
(2) Embalaje de la columna
Limpiar la columna de cromatografía y fijarla verticalmente en el soporte de cromatografía. Añadir 1/3 del volumen de agua desionizada, abrir la salida inferior y dejar fluir. flujo de agua Si está desbloqueado, coloque inmediatamente el material de la columna de concentración adecuada en un vaso de precipitados pequeño y viértalo suavemente en la columna de cromatografía. El gel se asentará naturalmente lentamente y luego al fondo de la columna de cromatografía. está a 1,5-2 cm del extremo superior de la columna de cromatografía. Deje de llenar la columna. La entrada de líquido en el extremo superior de la columna de cromatografía está conectada a la bomba de flujo constante y la salida inferior está conectada al monitor de proteínas hasta que la columna de cromatografía esté equilibrada.
(3) Balanza
La columna de cromatografía debe equilibrarse antes de cargar la muestra para la cromatografía en columna. La llamada balanza significa que la solución en la columna de cromatografía se mezcla con el tampón. del proceso de cromatografía (eluyente) se reemplaza para que el sistema tampón en la columna de cromatografía sea consistente con el sistema durante la cromatografía en columna.
El método es: usar la bomba de flujo constante en el extremo superior de la columna de cromatografía para bombear el tampón de equilibrio a la columna de cromatografía, abrir la salida en el extremo inferior de la columna de cromatografía, el caudal del líquido de equilibrio es 0,5-1 ml /min, y el valor de pH del efluente de salida es La columna alcanza el equilibrio cuando el pH del tampón de equilibrio es constante. En este experimento, la columna DE-52 se preequilibró con tampón Tris-HCL 0,002 M, pH 7,4 (que contenía EDTA 0,0001 M).
5． Carga:
Cargue la solución de enzima eluida en la muestra y utilice un tampón Tris-HCL 0,02 M, pH 7,4 (que contiene EDTA 0,001 M) para eluir las proteínas impurezas.
6. Elución:
Utilice tampón Tris-HCL 0,02 M, pH 7,4 (que contiene EDTA 0,001 M) que contenga NaCL (0,2-0,6 M) para la elución en gradiente.
7. Determinación de la actividad enzimática y concentración de proteínas
Experimento 3 Determinación de la actividad de la PPO
1. Principios y métodos
La PPO cataliza la oxidación de diversos fenoles y O2 a quinonas. Este experimento utiliza catecol como sustrato. En el sistema de reacción de hidrógeno fosfato disódico 0,2 M y tampón de ácido cítrico 0,1 M, pH 5,8, la PPO cataliza el catecol para formar quinona marrón. El espectrofotómetro a 410 nm. El valor de DO del sistema de reacción cambia en este momento. , y la actividad enzimática de PPO está determinada por el cambio de lectura del aumento en el valor de OD.
El método es: añadir 0,05 ml de solución de catecol 0,05 M en un tubo de ensayo que contiene 4 ml de tampón de hidrógeno fosfato disódico 0,2 M-ácido cítrico 0,1 M a pH 5,8 y precalentar a una temperatura constante de 30 °C. baño de agua Después de calentar, añadir 0,05 ml de solución enzimática, reaccionar durante 5 minutos y leer el valor de absorbancia a 410 nm en un espectrofotómetro. En las condiciones anteriores, tome la lectura de A410 y defina una unidad de actividad enzimática (U) aumentando el valor en 0,01 D.O. por minuto.
II. Instrumentos y reactivos
(1) Muestra:
Solución de enzima cruda de polifenol oxidasa
Componente de precipitación de sulfato de amonio
Componente de elución DE-52
Componente de elución en gel de sefarosa
(2) Sustrato:
Catecol: solución de catecol O.01M
(3) Sistema de reacción:
Dihidrogenoftalato de sodio 0,2 M-tampón de ácido cítrico 0,1 M pH 5,8
(4) Utensilios e instrumentos:
Tubos de ensayo, baño maría a temperatura constante, etc.
Espectrofotómetro
3. Actividad específica de la proteína enzimática
Actividad específica = unidad de actividad enzimática (U)/ mg de proteína
IV.Resultados experimentales y análisis
1. Componentes de elución de Sephadex G-200 Concentración relativa (OD590) y actividad enzimática relativa (OD410)
Lista de resultados
Número de tubo de ensayo concentración de proteína actividad de la enzima PPO Número de tubo de ensayo concentración de proteína actividad de la enzima PPO
Blanco 0 0 3 0,16 0,09
Solución enzimática bruta 0,20 0,14 4 0,03 0,03
1 0,00 0,01 5 0,03 0,01
2 0,13 0,09 6 0,02 0,02
Análisis: Los tubos de ensayo 2 y 3 contienen la mayoría de las proteínas necesarias y se guardan para el siguiente paso de purificación.
2. Concentración relativa (OD590) y actividad enzimática relativa (OD410) de los componentes eluidos de DE-52
Lista de resultados
Número de tubo de ensayo de concentración de proteína. Actividad de la enzima PPO número de tubo de ensayo concentración de proteína Actividad de la enzima PPO
En blanco 0 0 3 0,03 0,05
Solución de enzima cruda 0,22 0,16 4 0,09 0,05
1 0,00 0,00 5 0,07 0,02
2 0,03 0,02 6 0,03 0,00
Análisis: El nivel de actividad enzimática no es necesariamente proporcional al nivel de contenido de proteína. Los tubos de ensayo 3 y 4 contienen más de lo requerido. proteína.
Experimento 4: Separación y extracción de tripsina
1. Principio y finalidad
El método clásico de extracción y preparación de enzimas utiliza principalmente precipitación fraccionada con sulfato de amonio y tripsina. Se incuba con una saturación del 75 % de sulfato de amonio, otras impurezas generalmente se precipitan y se eliminan con una saturación del 10 % de sulfato de amonio. Después de múltiples extracciones, finalmente se obtuvieron cristales en tampón de ácido bórico a pH 8,0.
La pcreatina es la más estable a pH 3,0 y puede almacenarse a bajas temperaturas durante mucho tiempo sin inactivación; a niveles de pH más bajos, la enzima es más susceptible a la desnaturalización cuando el pH es superior a pH 5; , la enzima se pierde fácilmente debido a la autólisis viva. Por lo tanto, todo el proceso operativo de extracción y preparación de tripsina debe realizarse a baja temperatura y bajo pH. La pancreatina está presente en el páncreas de los animales como zimógeno inactivo. El tripsinógeno puede activarse mediante enteroquinasa e iones de calcio o autociclarse en enzimas activas en condiciones fisiológicas normales. El peso molecular del tripsinógeno porcino es de aproximadamente 24.000 a 25.000, mientras que el peso molecular de la tripsina porcina es de 23.400. Durante el proceso de activación del zimógeno, se rompe una cadena peptídica entre Lys e Ile en el extremo N del zimógeno, se pierde un 6-péptido, la conformación molecular cambia y el PI pasa a ser 10,8.
Este experimento pretende dominar las técnicas operativas de preparación de enzimas, separación general, extracción, purificación y cristalización mediante la preparación de un experimento de cristalización de enzimas pancreáticas a partir de páncreas de cerdo. Al mismo tiempo, prepare muestras experimentales para experimentos de inmunología y cromatografía de afinidad.
2.Materiales y reactivos
1. Instrumentos
Espectrofotómetro UV, baño de agua a temperatura constante, centrífuga, triturador de tejidos, medidor de pH, microscopio, cronómetro, tijeras, pinzas, recipiente esmaltado, mortero, embudo de vidrio grande, botella filtrante, cubos de plástico, gasa, PH Papel de prueba, papel de filtro, cristalería, etc.
2. Material: páncreas de cerdo fresco
3. Reactivos y preparación de la solución
pH 2,5 agua acidificada con ácido acético, solución de H2SO4 2,5 M, solución de NaOH 2 M, solución de NaOH 5 M, solución de HCL 01 M, solución de HCL 0,025 M, solución de HCL 0,01 M, pH 0,4 M9 0 tampón de ácido bórico (la solución madre es 0,8 M, dilúyala dos veces cuando se use), Tris, sulfato de amonio.
Tampón de ácido bórico 0,8M pH9.0: Tomar 20ml de solución de tetraborato de sodio 0,8M, mezclar y calibrar con un medidor de pH.
3. Pasos de la operación
1. Extracción y separación de tripsinógeno:
(1) Pesar 1-1,5 kg de páncreas de cerdo fresco, eliminar la grasa y el tejido conectivo en un baño de hielo y picar el páncreas con una picadora de carne a baja temperatura (o triturarlo). con un homogeneizador de tejidos de alta velocidad), añadir 1-2 veces el volumen y extraer con solución acuosa acidificada de ácido acético PH2,5-3,0 preenfriada (1 g de tejido equivale a 1 ml de volumen, y así sucesivamente). Verifique el pH en la solución de extracción. Si es superior a 3,0, ajústelo con ácido acético al 10 % a tiempo para mantener el pH de la solución de extracción entre 2,5 y 3,0. Agitar y extraer en una habitación fría a aproximadamente 5 °C durante 18 a 24 horas, luego filtrar con 4 capas de gasa y exprimir el filtrado tanto como sea posible. El filtrado es de color blanco lechoso. Utilice aproximadamente 300 ml de ácido acético acidificado con pH 2,5. agua para extraer el residuo nuevamente (el tiempo es de aproximadamente 1 a 2 horas). Combine el filtrado. En este momento, el valor de pH del filtrado es relativamente alto. Puede usar una solución de H2PO4 5 M para ajustar el pH a 2,5-3,0. dejándolo durante 3-5 horas, utilizar un embudo de vidrio para filtrar el filtrado turbio de forma natural. El filtrado se convierte en un líquido amarillo transparente. Recoger el filtrado y medir su volumen total, desechando el sedimento.
(2) Salado: Agregue sulfato de amonio sólido en polvo al filtrado para salar, llevando la solución a una saturación del 75%. Coloque la solución salada en una habitación fría durante la noche y centrifugúela con una centrífuga de 4000 r/min al día siguiente, o fíltrela con un embudo Buchner. Presione la torta de filtración hasta sequedad y luego pésela para obtener aproximadamente 20 g de tripsinógeno crudo. producto.
(3) Activación del tripsinógeno: diluya el tripsinógeno crudo con 10 veces el volumen de agua destilada fría y agréguelo varias veces para disolver la torta de filtración. La solución será de color blanco lechoso y mida su volumen. Saque 1 ml de la solución. Se utiliza para determinar el contenido de sulfato de amonio en la solución (aproximadamente 1/4 del peso de la torta de filtración). Debido a que el sulfato de amonio puede combinarse con los iones de calcio activadores para generar sulfato de calcio, si hay muy pocos iones de calcio, afectará directamente el proceso de activación del tripsinógeno y agregue lentamente el CaCL2 sólido finamente molido a la solución de zimógeno. y revuelva uniformemente. Ajustar el pH a 8,0 con solución de NaOH 5 M. Añadir unos 5 mg de tripsina porcina cristalizada a la solución enzimática, agitar suavemente y colocar en un refrigerador a 5°C para activar el zimógeno.
(4) Purificación: elimine las proteínas impurezas, mida el volumen de la solución de tripsina, ajuste el pH del filtrado a 2,5-3,0 con una solución de ácido sulfúrico 5 M, elimine el precipitado de sulfato de calcio mediante filtración por succión, el El volumen del filtrado es de aproximadamente 1000 ml, agregue el polvo de sulfato de amonio molido hasta obtener un polvo fino para que la solución alcance el 40 % de saturación (agregue 242 g de sulfato de amonio por litro de filtrado). Colocar en un refrigerador a 5°C durante 5-8 horas, luego filtrar para eliminar el precipitado.
Experimento 5: Aislamiento y extracción de proteína de clara de huevo
1. Propósito y principio del experimento
La mucina de huevo de gallina existe en la clara de huevo y tiene un fuerte efecto. Afinidad por el efecto inhibidor de la tripsina, la proporción molecular de la mucina de huevo de gallina de alta pureza y la enzima molecular de la tripsina es de 1:1. La mucina de huevo de gallina es bastante estable al calor y a altas concentraciones de urea en soluciones neutras o ácidas, pero es menos estable en soluciones alcalinas.
Dado que la mucina de huevo de gallina tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la tripsina, la mucina de huevo de gallina se puede utilizar como ligando de afinidad para preparar materiales de afinidad para purificar la tripsina.
2.Materiales y reactivos:
1. Materiales: 2 huevos frescos
2: Instrumentos: Frasco filtrante de succión de 500-1000ml, embudo sinterizado, pipeta, agitador magnético
3: Reactivos:
10% TCA, use NaOH sólido para ajustar el pH a 1,05-1,10, lo que requiere 50 ml, HCL 5 N, NaOH 5 N, acetona fría, solución de tripsina, BAEE-0,05 M, tampón Tris-HCL PH8,0 (cada ml contiene 0,34 BAEE y 2,22 mg CaCL2 ), 50 ml
pH 8,0, tampón Tris-HCL 0,1 M
3. Pasos de la operación
1. Tome dos huevos frescos y obtenga 50 ml de clara de huevo. , colóquelo en un vaso de precipitados y use un baño de agua tibia para uso externo a 25 ℃ -30 ℃. En condiciones de agitación constante, agregue lentamente un volumen igual de ácido tricloroacético-acetona (1: 2 V / V) y una gran cantidad. Inmediatamente aparecerá un precipitado floculante blanco. Después de la adición, el pH final es de aproximadamente 3,5, continúe agitando durante 30 minutos y luego colóquelo en el refrigerador a 4°C durante la noche.
2. Utilizar un embudo Buchner para filtrar al día siguiente y obtener un líquido transparente de color amarillo verdoso.
3. Mientras se agita, añadir 200 ml de acetona preenfriada a 4°C para precipitar la proteína. Después de dejarla a 4°C durante 2 horas, verter con cuidado el sobrenadante en una botella para su recuperación. Centrifugar la parte inferior del sedimento a 4000 rpm durante 5 minutos para recoger el precipitado.
4. Disolver el precipitado en 10 ml de agua desionizada, dializarlo contra agua desionizada (50 veces) durante 4 horas, cambiar el agua dos veces, luego dializarlo contra tampón de carbonato de sodio durante la noche y centrifugar a 4000 rpm. durante 10 minutos para eliminar la materia insoluble.
Experimento seis: Purificación de tripsina mediante cromatografía de afinidad
1. Propósito y principio del experimento
Una de las características importantes de los compuestos macromoleculares biológicos es que tienen propiedades similares a ciertas La capacidad de las moléculas correspondientes para unirse específicamente a través de enlaces secundarios o enlaces de valencia primarios es la afinidad. Por ejemplo, entre enzimas e inhibidores, y entre antígenos y anticuerpos, las partes de unión no sólo son específicas, sino que también pueden disociarse mediante métodos físicos o químicos sin perder actividad biológica. De acuerdo con esta característica, si un lado de un par de moléculas con afinidad está conectado a un portador sólido insoluble en agua como fase estacionaria, cuando el otro lado fluya a través de la fase estacionaria con la fase móvil, ambos lados tendrán afinidad. obligado a formar uno en general. Entonces, sólo cambiando ciertas condiciones físicas o químicas para disociar las dos partes unidas, se puede obtener una sustancia específica con afinidad específica por la fase estacionaria. Este método de cromatografía establecido mediante la utilización de las propiedades de disociación y unión por afinidad entre moléculas biológicas y las moléculas correspondientes se llama cromatografía de afinidad.
En este experimento, la mucina de huevo de gallina inhibidor de tripsina se acopla a Sephadex-G75 y se utiliza la operación de purificación de tripsina mediante cromatografía de afinidad para comprender los principios básicos de la cromatografía de afinidad y dominar los procesos básicos. y técnicas de acoplamiento de activación de material de columna y operaciones de cromatografía de afinidad.
2. Instrumentos y reactivos
1. Preparación de mucina de huevo de gallina
2. Activación y acoplamiento de Sephadex-G75
2,5 g de Sephadex-G75 en peso seco, 50 ml de solución de NaCL 0,05 M, 87,5 mg de mucina de huevo de gallina purificada, 5 % de K2CO3, 0,27 g de KBH4 (disuelto en 20 ml de agua)
3. Cromatografía de afinidad
Tris-HCL 0,1 M pH 7,5 (que contiene KCL 0,5 M, CaCL2 0,05 M) 200 ml, tripsina bruta aproximadamente 50 ml, formiato de potasio 0,1 N, KCL 0,5 M pH 2,5 100 ml
Instrumentos y equipos: botella filtrante de 500-1000 ml, columna de cromatografía, espectrofotómetro UV, detector de proteínas UV, vaso de precipitados, embudo, pipeta, agitador magnético
3. Preparación de mucina de huevo de gallina
2. Activación y acoplamiento de Sephadex-G75
Se hinchan 2,5 g de peso seco de Sephadex-G75 y se lavan varias veces, se agita lentamente, se añaden 50 ml de. Solución de NaCL 0,05 M durante 30 min, lavar varias veces con agua destilada, escurrir y reservar, activar el gel, disolver 87,5 mg de mucina de huevo de gallina purificada en 35 ml de agua, añadir dextrano activado Gel de azúcar, 75 % K2CO3, ajustar el pH a 7,5 -9,0, revuelva lentamente durante 3 horas. Se añadió K2CO3 al 5% en cualquier momento durante la reacción para mantener la estabilidad del pH. Disolver 0,27 g de KBH4 en 20 ml de agua, agitar lentamente y añadir al sistema anterior, reaccionar durante 5 horas, mantener el pH entre 6,5 y 7,5 y lavar.
3. Cromatografía de afinidad de tripsina
La ovomicina se puede unir específicamente a la tripsina a pH 7-8, y a pH 2-3 se puede disociar, por lo que si se dominan las condiciones del pH y En las condiciones del tampón de elución de la columna, la tripsina se puede unir selectivamente a la columna desde la solución enzimática cruda que contiene proteínas impurezas, y las sustancias no unidas o no específicas se pueden eliminar por lavado. Después de unirse a la dioxina, la tripsina se puede eluir cambiando el valor del pH. Para lograr el propósito de la purificación. Debido a la especificidad de unión de la cromatografía de afinidad, el volumen de la columna puede ser relativamente grande para obtener productos purificados concentrados.
(1) Cromatografía de afinidad
Coloque mucina de huevo de gallina-Sephadex-G75 en una columna (1×10 cm), use pH 7,5, 0,1 M que contenga KCL 0,5 M, equilibre con 0,05 M CaCL2 tampón, equilibrar aproximadamente 2-3 veces el volumen de la columna. La solución de tripsina cruda se sometió a cromatografía en columna. Utilice un monitor de proteínas UV para detectar el pico de absorción de proteínas a 280 nm. Con el equilibrio de la cantidad de proteína de impureza en la columna y el flujo, el pico de absorción alcanza un nivel estable una vez que la cantidad de tripsina en la columna excede la carga. de la columna, la tripsina se desborda, provocando la absorción. Si el pico aumenta, se debe detener la carga de la muestra en este momento y las proteínas impurezas se deben lavar con un tampón de equilibrio de pH 7,5. Después de que la absorción del eluido regresa a la línea base. , en su lugar se debe utilizar formiato de potasio 0,1 N, KCL 0,5 M, Ph2 5 análisis de eluyente, el caudal de la columna se mantiene en aproximadamente 1,5 ml/min, se recoge la proteína del pico de proteína eluida, se calcula la cantidad total de proteína y la actividad específica. se mide y la afinidad se calcula en función de la cantidad total de proteína y la actividad específica de la muestra en la columna y el aumento de veces en la actividad específica de tripsina después de la cromatografía, la tasa de recuperación de proteína total y la cantidad de tripsina.
Cuando el pico de tripsina se elimina y la absorción de UV vuelve a la línea base, se vuelve a equilibrar con tampón y la columna de cromatografía de afinidad se puede utilizar repetidamente.
(2) Determinación de la actividad y proteína tripsina
Experimento 7 Determinación por SDS-PAGE del peso molecular de la proteína e identificación de la pureza de la proteína
Propósito y principio experimental<. /p>
Cuando una proteína se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida, su migración depende de factores como su carga, tamaño molecular y forma.
En 1967, Shapiro et al. descubrieron que si se añadía el detergente aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS) al sistema de poliacrilamida, la mayoría de las proteínas podrían unirse al SDS en una determinada proporción, es decir, se podrían unir 1,4 g de SDS por gramo de proteína. combinados. -Todos los complejos llevan cargas negativas de la misma densidad, su cantidad excede con creces la carga original de la molécula de proteína, eliminando así la diferencia de carga original de la proteína, de modo que la movilidad electroforética de la molécula de proteína depende principalmente de sí misma. peso molecular Independientemente de la carga transportada por la proteína, bajo ciertas condiciones, existe una correlación negativa entre el logaritmo del peso molecular de la proteína y la movilidad electroforética.
El propósito de este experimento es identificar la pureza de la polifenol oxidasa y determinar el peso molecular. A través del experimento, aprenda y domine la identificación de la pureza de las proteínas y el peso molecular mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
2. Instrumentos y reactivos
1. Materiales:
Muestra de enzima cruda de polifenol oxidasa precipitada mediante precipitación con sal de sulfato de amonio, muestra de cromatografía en columna DEAE-celulosa DE52, muestra de cromatografía en columna Sephadex G-100.
2. Reactivos:
(1) Acrilamida (Solución madre Acr): 30% Acr (Acr/Bis)
(2) Solución SDS 10%
(3 ) Solución de persulfato de amonio al 10%
(4) Tetrametiletilendiamina (TEMED)
(5) Tampón de gel separador: Tris 1,5 M, PH8
(6. ) Tampón de gel de apilamiento: Tris 1,0 M, PH6,8
(7) Tampón de electrodo: 10 × 30 g de Tris, 125 g de glicina y 5 g de SDS, agregue agua para disolver Diluir a 1000 ml, pH 8,3
(8) Tampón de muestra: Tris 0,2 M, pH 6,8, 1 % SDS, 30 % glicerol, mercaptoetanol y azul de bromofenol
(9) Solución de tinción: 0,15 % Coomassie Brilliant Blue R250, disuelto en solución decolorante
(10) Solución decolorante: 50% metanol, 7% solución acuosa de ácido acético glacial
(11) Proteína de peso molecular estándar.
3. Instrumentos y equipos:
Aparatos de electroforesis, tanque de electroforesis vertical, etc.
3. Pasos de la operación
1. Preparación del gel:
Utilice dos placas de vidrio de electroforesis para hacer una ranura de placa vertical (sin fugas de gel) y colóquelas. verticalmente. Vierta la solución de gel de separación preparada en la solución y agregue agua libre de iones gota a gota. Después de que se junte el gel, vierta el agua libre de iones, séquela con papel absorbente, vierta el gel concentrado e inserte el peine.
2. Carga de muestras:
Colocar varios ml de muestras en tubos de centrífuga, agregar 5x tampón de muestra en una proporción de 1/1-1/5 y calentar a ebullición. Baño María 3-5min, sacar y reservar. Utilice una microjeringa para extraer hasta 30 ul de muestras de proteínas estándar y probar muestras de diferentes concentraciones e inyectarlas en el tanque de muestra. Después de detectar, ajuste la corriente del instrumento de electroforesis a 10 mA (2-3 mA/em) para mantener la corriente estable. Cuando el azul de bromofenol migre a 1-2 cm del fondo del gel de separación, se puede detener la electroforesis.
3. Tinción:
Después de la electroforesis, retire la placa de gel, sumérjala en la solución de tinción e incúbela en una incubadora a 37 °C durante la noche. Retire la solución colorante y, después de 24 horas, podrá ver bandas de proteínas claras.
IV.Resultados (omitido)
V. Notas
1. La unión de SDS a la proteína es proporcional a la masa (es decir: 1,4 g de SDS/g de proteína). ), si la proporción es inapropiada, no se pueden obtener datos precisos.
2. Al medir el peso molecular relativo de las proteínas mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se debe realizar al mismo tiempo una curva estándar. Esta curva estándar no se puede utilizar la próxima vez.
3. Algunas proteínas están compuestas por subunidades (como la hemoglobina) o por más de dos cadenas peptídicas (α-quimotripsina) que se disocian en subunidades o subunidades bajo la acción del mercaptoetanol y del SDS. cadenas. Por lo tanto, para este tipo de proteínas, la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida solo mide el peso molecular relativo de sus subunidades o cadenas peptídicas individuales.
4. Algunas proteínas (como proteínas con carga o estructura anormal; proteínas con grandes grupos protésicos) no se pueden medir con este método.
5. Si hay colas o un fondo poco claro en la banda teñida durante la electroforesis, puede ser causado por SDS impuro.
La electroforesis por enfoque isoeléctrico (IEF) separa proteínas y determina los puntos isoeléctricos de las proteínas.
1. Principio
El enfoque isoeléctrico (IEF) se realiza en un campo eléctrico. Un avance importante En la tecnología de separación de proteínas, el enfoque isoeléctrico es un método de electroforesis en equilibrio que separa macromoléculas anfifílicas según diferentes puntos isoeléctricos en un gradiente de pH estable.
El campo eléctrico se llena de portadores anfóteros y medios anticonvección. Cuando se añade el campo eléctrico, debido al movimiento de los portadores anfóteros, se establece gradualmente un gradiente de pH estable entre los dos polos. Existen moléculas de proteína u otras moléculas anfóteras. Cuando se encuentra en tal gradiente de pH, esta molécula se moverá en este campo eléctrico debido a su carga superficial y eventualmente alcanzará una zona donde su carga electrostática superficial es 0. El pH en este momento es el pi. de la molécula. Las moléculas en el punto isoeléctrico también continuarán difundiéndose. Una vez que se desvían de su punto isoeléctrico, debido a los cambios en el entorno de pH, las moléculas inmediatamente ganan cargas positivas o negativas y migran a pi. Por tanto, estas moléculas están siempre en equilibrio de difusión y antidifusión continua, y están "focalizadas" en el pI.
Instrumentos y reactivos
1. Materiales: muestra de proteína
2. Reactivos:
Poliacrilamida, poliacrilamida, electrolito anfótero, urea, NP-40, teiton-100
Solución de electrodo: ácido fosfórico 1 M (anolito), hidróxido de sodio 1 M (catolito)
Solución fijadora: 100 g de ácido tricloroacético, 10 g de ácido sulfosalicílico disueltos en 500 ml, ajuste el volumen a 1000 ml
Solución de tinción: 0,35 g de Coomassie Brilliant Blue R -150 se disuelven en 300 ml de solución decolorante, Se calienta a 60-70°C y se añaden 0,3 g de sulfato de cobre.
Solución decolorante: 25% etanol, 8% ácido acético glacial disuelto en agua
Tampón de muestra: 1% Ampholine, 2% Triton X-100, urea 9M
3. Pasos de la operación:
1. Preparación de la muestra:
Utilice el tampón de muestra IEF para extraer la muestra a analizar. Las muestras extraídas con otros tampones deben dializarse y liofilizarse. y luego reconstituido en tampón de muestra IEF. Después de la disolución completa, centrifugar para eliminar las impurezas insolubles.
2. Fabricación de moldes:
Limpiar dos placas de vidrio especiales IEF y realizar un tratamiento de siliconación y desiliconización. Las superficies de siliconación y desiliconización de las dos placas de vidrio son opuestas entre sí. otro y coloque las tiras, engánchelas.
3. Preparación del pegamento:
Composición del pegamento: 6ml de licor madre de pegamento (10%, 19/1)
6-8% de urea
1ml Anfolina (pH3.5-10)
60-80ul 10%AP
5 ul TEMED
4, relleno de pegamento: preparado El gel se vierte rápidamente en el molde
5. Electroforesis:
Después de que el gel se solidifique, retire con cuidado las placas de vidrio superior e inferior, seque el fondo de la junta de plástico y colóquela con cuidado. en el tanque de electroforesis. Coloque una tira de electrodos empapada en tampón de electrodos a cada lado de la superficie del gel. Coloque un pequeño trozo de papel para limpieza de lentes en cualquier posición de la superficie del gel, agregue una muestra sobre el papel, cubra la tapa y realice la electroforesis con una potencia transversal de 25 W. Después de aproximadamente 10 minutos, haga una pausa en la electroforesis y retire el trozo de papel. y continúe la electroforesis durante aproximadamente 30 minutos hasta que la corriente alcance el valor inferior a 4 mA, detenga la electroforesis.
6. Determinar el pI de la proteína con electrodos de superficie
7. Fijación: sacar la pieza de plástico y meterla en el fijador durante 15 minutos.
8. Tinción: sacar la pieza de plástico. Ponerla en la solución colorante para teñir a 65°C hasta que aparezca la banda.
9. .
IV.Resultados (omitido)
V. Notas
1. El anfolito es el reactivo clave para el enfoque isoeléctrico y su contenido es del 2 % al 3 %. es más adecuado y puede formar un mejor gradiente de pH.
2. Lo mejor es recristalizar la acrilamida.
3. El persulfato de amonio debe estar recién configurado.
4. Utilice agua bidestilada para toda el agua.
5. La muestra debe estar libre de iones, de lo contrario la banda de muestra podría distorsionarse, arrastrarse o no formarse en absoluto durante la electroforesis.
6. El gel de la electroforesis de enfoque isoeléctrico de placa plana es muy delgado. Cuando la corriente es estable a 8 mA y el voltaje aumenta a más de 550 V, debido a la deriva del cátodo, la corriente local es demasiado grande y el. El gel no puede soportarlo y se quema.