Cómo detectar la apoptosis mediante citometría de flujo
Introducción
La apoptosis, a menudo llamada muerte celular programada, es un proceso de muerte celular activa controlado por genes. Cada vez más datos han encontrado que la apoptosis celular está estrechamente relacionada con una variedad de enfermedades. Por ejemplo, las células cancerosas tienen las características de proliferación continua y resistencia a la apoptosis. El uso de la citometría de flujo para analizar la apoptosis celular puede proporcionar información útil para el diagnóstico de tumores. , evaluación de eficacia y predicción de pronóstico Proporcionan importantes indicadores de referencia. Sin embargo, muchos estudiantes que realizan experimentos a menudo encuentran fenómenos como muerte celular excesiva pero no se detecta apoptosis en línea y resultados inconsistentes repetidos varias veces. ¡Este artículo analizará cómo hacer que los datos de apoptosis sean más hermosos y precisos!
En primer lugar, aclarar la diferencia entre apoptosis y necrosis.
La apoptosis es un evento de muerte celular activa que implica la activación, expresión y regulación de una serie de genes. Proceso de muerte que se adapta al medio. La amitosis es un evento de muerte celular activa que implica la activación y regulación de una serie de genes. Se caracteriza por varios procesos secuenciales, como la gemación para formar vesículas apoptóticas, la escisión del ADN entre ribosomas y la fagocitosis y digestión de vesículas apoptóticas [1] (como se muestra en la figura siguiente).
Figura 1: El proceso de apoptosis [1]
La necrosis es un proceso pasivo, que es un tipo de muerte celular causada por fuertes factores físicos, químicos o biológicos que alteran la célula. en el proceso hay un fenómeno de autolesión en un estado patológico. Las manifestaciones específicas incluyen: hinchazón celular, ruptura de la membrana celular, desbordamiento del contenido celular, cambios nucleares lentos y degradación insuficiente del ADN, que pueden causar reacciones inflamatorias locales graves (como se muestra en la figura siguiente).
Figura 2: El proceso de necrosis celular [1]
1. Principio de la detección de apoptosis por citometría de flujo
El método de doble tinción con anexina V y PI es un El método clásico de detección de apoptosis por citometría de flujo se basa en la detección de fosfotidilserina en la membrana celular en las primeras etapas de la apoptosis. El principio es que la fosfatidilserina (PS) en la membrana celular voltea desde el interior de la membrana celular hacia la superficie de la membrana celular en las primeras etapas de la apoptosis (Figura 3 a continuación).
Figura 3: En la etapa inicial de la apoptosis, la PS voltea desde el interior de la membrana celular
Este método es simple, rápido y preciso, y puede usarse para distinguir células vivas. , células apoptóticas y células necróticas. El principio es el siguiente:
Por lo tanto, cuando la anexina V se usa en combinación con PI, se puede usar para distinguir células vivas, células apoptóticas y células muertas.
Por tanto, cuando se utiliza Anexina V en combinación con PI, se puede utilizar para identificar células vivas, células apoptóticas y células muertas.
El kit de detección de apoptosis de Anexina V-FITC/PI utiliza Anexina V marcada con FITC como sonda. Su longitud de onda de excitación máxima es de 488 nm, su longitud de onda de emisión máxima es de 525 nm y su longitud de onda de emisión máxima es de 525 nm. . La longitud de onda de excitación máxima de FITC es de 488 nm y la longitud de onda de emisión máxima es de 525 nm. La fluorescencia verde de FITC se detecta en el canal FL1. La longitud de onda de excitación máxima del complejo PI-ADN es de 535 nm. es 615 nm En FL2 o FL3 El canal detecta la fluorescencia roja de PI. Con FITC como abscisa y PI como ordenada, utilice el software para analizar el diagrama de dispersión de dos colores.
Como se muestra en la siguiente figura: las celdas se pueden dividir en 4 cuadrantes:
Figura 4: Distribución de celdas en los 4 cuadrantes
Ejemplo: como comúnmente utilizado Estudiar los efectos de fármacos o genes sobre la apoptosis. Al comparar el grupo de control y el grupo de fármaco, se encontró que el compuesto indujo apoptosis en la línea celular de cáncer de próstata PC-3M. En comparación con el grupo de control (0 μM), el porcentaje de células apoptóticas tardías en el grupo de tratamiento (20. μM) aumentó de 1,79 a 11,39. A su vez, a partir de los datos de cada cuadrante también se pueden calcular los porcentajes de células viables, células apoptóticas y células necróticas.
Figura 5. Inducción de la apoptosis de las células PC-3M dependiente del gradiente de concentración del fármaco[2]
IV. resultados positivos?
2. ¿Por qué es importante recoger el sobrenadante celular?
Debido a que las células apoptóticas pueden secarse y quedar suspendidas en el medio de cultivo, el sobrenadante debe recogerse y centrifugarse para obtener un sedimento que contenga células tripsinizadas, de lo contrario el porcentaje de apoptosis detectado puede verse reducido.
3. ¿Por qué es importante realizar la prueba dentro de 1 hora después de la tinción?
Debido a que la apoptosis es un proceso rápido, se recomienda analizar la muestra dentro de 1 hora después de la tinción; el PI se ve muy afectado por el tiempo, porque el PI marcado aumentará la citotoxicidad, especialmente en la etapa temprana de detección. apoptosis celular, si el tiempo se prolonga, además de aumentar los espacios entre grupos de células en el citómetro de flujo, el error también aumentará significativamente. Se recomienda detectar células apoptóticas en 1 hora. Por tanto, se recomienda detectar las células en el plazo de una hora.
4. Otras precauciones
Bibliografía:
[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programed cell death.Toxicol Pathol 2007;35:495- 516.
[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, un nuevo compuesto sintético con actividad antimicrotúbulo en células de cáncer de próstata, ejerce una actividad antitumoral eficaz.[J].Journal of Pharmacology y Terapéutica Experimental, 2015, 355(3): 473-483..