Cómo tratar la suspensión de muestras con ácido tricloroacético

Experimento de precipitación con ácido tricloroacético

Hora de publicación: 2020-08-17 14:16 Enlace original: Experimento de precipitación con ácido tricloroacético

Reactivo, kit acetona Estándar de peso molecular Tampón de muestra TCA DOC con y sin 2-mercaptoetanol

Instrumentos y consumibles Tubos de microcentrífuga de polipropileno

Procedimientos experimentales

Materiales y equipos

Acetona (Aldrich Chemical Co.Inc.)

Nota: Almacenar a temperatura ambiente. No se puede colocar en el frigorífico.

Tubo de microcentrífuga de polipropileno (1,5 ml)

Nota: 1. Lave el tubo de centrífuga antes de su uso. 2. Cuando se analizan cantidades muy pequeñas de proteína (lt; 100 ng), puede ser necesario silanizar el tubo de centrífuga de la siguiente manera: Remoje el tubo de centrífuga en 5 (v/v) de diclorodimetilsilano (Aldrich) durante un tiempo breve (5 min). Chemkai Co.Inc.) en solución de cloruro de vinilo, y luego se lavó con etanol (100) y agua destilada de vidrio. Seque el tubo de centrífuga a temperatura ambiente durante al menos 1 día. Después de la silanización, algunas proteínas se unen firmemente al polipropileno. Desafortunadamente, esta propiedad es relativamente empírica y no es posible saber de antemano si la proteína que se va a analizar permanecerá en las paredes de los tubos de centrífuga de polipropileno lavado o silanizados.

Estándar de peso molecular (opcional)

Reactivos y tampones

TCA DOC

Muestras con y sin Tampón 2-mercaptoetanol (1X)

(Receta, ver "Preparación de Reactivos y Tampones", Pág.262)

Procedimiento Operativo

1) Añadir 1/ Añadir 4 volúmenes de TCA DOC a la fracción de proteína (en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml) para dar una concentración final de TCA de 20 (p/v). Agite para mezclar.

2) Incubar en hielo durante 20~30 minutos.

3) Microcentrífuga, centrifugar a temperatura ambiente durante 15 minutos. El precipitado, si es visible, es un gel viscoso de color marrón amarillento. Aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur fina. Intente eliminar la mayor cantidad de sobrenadante posible. Si se toman 100 ul de muestra para precipitación, el precipitado será visible.

4) Añadir 3 veces el volumen de acetona (temperatura ambiente) (volumen de muestra original). Dejar reposar la muestra a temperatura ambiente durante unos 10 minutos para permitir que el TCA DOC se disuelva en acetona.

5) Centrifugar a temperatura ambiente durante 15 minutos. En ese momento, el tamaño y las propiedades físicas del sedimento son similares a un poco de polvo. Se pueden observar aproximadamente 10ug o más de proteína. A veces se obtiene un precipitado de sal blanca (como KCl, etc.). Retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur muy fina. El precipitado se colocó en hielo para secar durante 10 minutos (abra la tapa del tubo de centrífuga de 1,5 ml). El pellet seco se puede almacenar a -20°C durante largos períodos de tiempo (gt; 1 mes).

6) Disuelva el sedimento con tampón de muestra (lx) que contenga 2-mercaptoetanol (para dispositivos de gel de losa pequeña estándar, use 6 ul). Si todavía queda una pequeña cantidad de residuos de TCA, el azul de bromofenol se volverá amarillo. Esto no importa ya que existe suficiente capacidad tampón para neutralizar trazas de TCA durante la electroforesis. Si hay KCl residual en el precipitado, se formará un precipitado blanco floculento (dodecilsulfato de potasio) cuando se agregue el tampón de muestra a la proteína precipitada. Si precipita lauril sulfato de potasio, será difícil cargar la muestra en el gel SDS, pero una vez cargada la muestra en el gel, la electroforesis se desarrollará bien.

7) Si se requiere una referencia estándar de peso molecular, el estándar de peso molecular (PM) de la proteína se puede preparar en una solución madre que contenga 0,5 mg de proteína total por ml usando un tampón de muestra lxSDS sin 2-mercaptoetanol. Dividir en pequeñas alícuotas (50ul) y almacenar a -20°C. Para la tinción con plata, tome 2 ul de estándar de peso molecular y 4 ul de tampón de muestra que contenga 2-mercaptoetanol hasta un volumen final de