Cómo hacer una curva estándar para QPCR
La curva estándar para QPCR se puede preparar mediante el método PCR-ELISA.
Los detalles son los siguientes:
Método PCR-ELISA:
Utilizando cebadores marcados como digoxigenina o biotina, el producto amplificado se amplifica específicamente sobre el sólido. Se une la sonda;
Luego se añade antidigoxigenina o conjugado de anticuerpo marcado con enzima biotinilada y peroxidasa de rábano picante, y la enzima final hace que el sustrato desarrolle color.
El método PCR-ELISA convencional es sólo un experimento cualitativo. Agregar estándares internos y hacer una curva estándar también puede lograr propósitos de detección cuantitativa.
Midiendo una determinada propiedad física y química de una serie de materiales estándar con componentes conocidos, se obtiene una curva compuesta por el valor numérico de la propiedad.
Información ampliada:
La tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real agrega grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR, utiliza la acumulación de señales de fluorescencia para monitorear todo el proceso de PCR en tiempo real y, finalmente, utiliza la curva estándar para analizar la plantilla desconocida Métodos para realizar análisis cuantitativos.
Método de detección:
1. Método SYBR Green I:
En el sistema de reacción de PCR, agregue el exceso de tinte fluorescente SYBR y el tinte fluorescente SYBR es específico. incorporado al ADN. Después de la doble cadena, se emite una señal fluorescente.
Las moléculas de colorante SYBR que no estén incorporadas a la cadena no emitirán ninguna señal fluorescente, asegurando así que el aumento de la señal de fluorescencia esté completamente sincronizado con el aumento del producto de la PCR.
Curva de fluorescencia de amplificación por PCR cuantitativa SYBR y curva de fusión del producto de PCR (el diagrama de pico único indica la unidad del producto de amplificación por PCR).
2. Método de la sonda TaqMan:
Cuando la sonda está intacta, la señal fluorescente emitida por el grupo informador es absorbida por el grupo de extinción;
Amplificación por PCR En este momento, la actividad exonucleasa 5'-3' de la enzima Taq escinde y degrada la sonda, lo que hace que el fluoróforo informador y el fluoróforo extintor se separen, de modo que el sistema de monitoreo de fluorescencia pueda recibir la señal de fluorescencia.
Es decir, cada vez que se amplifica una hebra de ADN se forma una molécula fluorescente, consiguiendo una completa sincronización entre la acumulación de señales fluorescentes y la formación de productos de PCR.
La señal de fluorescencia de los primeros 15 ciclos de la reacción de PCR se utiliza como señal de fondo de fluorescencia. La configuración predeterminada (predeterminada) del umbral de fluorescencia es 10 veces la desviación estándar de la señal de fluorescencia de 3-. 15 ciclos, es decir: umbral = 10*SDciclo 3-15.
Se puede dibujar una curva estándar utilizando estándares con número de copia inicial conocido, en la que la abscisa representa el logaritmo del número de copia inicial y la ordenada representa el valor Ct. Por lo tanto, siempre que se obtenga el valor Ct de una muestra desconocida, el número de copia inicial de la muestra se puede calcular a partir de la curva estándar.
Materiales de referencia:
Enciclopedia Baidu-Cuantificación de fluorescencia en tiempo real
Enciclopedia Baidu-Curva estándar