¿Cuáles son los métodos de pruebas genéticas?
1 Método de secuenciación de primera generación
1.1 El método de secuenciación de Sanger utiliza el método de secuenciación directa
1977. En 2000, Frederick Sanger y otros inventaron el método de terminación del extremo de la cadena didesoxi, que inmediatamente se convirtió en la tecnología de secuenciación de genes más utilizada. En 2001, Allan Maxam y Walter Gibert inventaron la secuenciación de Sanger, que durante la siguiente década se convirtió en el estándar de oro para las pruebas genéticas. La razón es que los trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddNTP) carecen del 3'-OH necesario para la extensión de la PCR, por lo que la extensión finaliza tan pronto como se agrega una molécula de ddNTP a la cadena de ADN. Cada secuenciación de ADN consta de cuatro reacciones independientes, en las que plantillas, cebadores y cuatro ddNTP que contienen diferentes nucleótidos marcados con radioisótopos se mezclan con ADN polimerasa, respectivamente, para formar fragmentos de diferentes longitudes. Hay una gran cantidad de puntos de partida en el sistema de reacción. Los fragmentos de ADN con diferentes puntos de terminación se pueden separar en secuencias de ADN con diferentes bases individuales mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida, obteniendo así bandas de autorradiografía de radioisótopos. La secuencia de bases de las dobles cadenas del ADN se puede leer en las tiras de electroforesis.
La secuenciación del genoma humano se basa en esta tecnología, y la secuenciación de Sanger es un método de secuenciación directa con alta precisión, operación simple y alta velocidad. En la actualidad, el método de secuenciación de Sanger todavía tiene un gran valor práctico en la identificación de genes para enfermedades genéticas clínicas en muestras pequeñas. Por ejemplo, la secuenciación directa de Sanger del gen FGFR2 confirmó el síndrome monogénico de Abbott, y la secuenciación directa del gen TCOF1 detectó hasta el 90% de las mutaciones asociadas con el síndrome de TreacherCollins. Vale la pena señalar que el método de secuenciación de Sanger diseña cebadores para los sitios de mutación de genes conocidos que causan enfermedades y los amplifica directamente mediante PCR para la secuenciación. La amplificación de un único sitio de mutación es suficiente para incluir fragmentos de exones dentro de ese sitio, en lugar de amplificar todos los exones del gen en el que se encuentra el sitio.
Por lo tanto, es necesario localizar claramente el exón del gen donde se encuentra el sitio a amplificar y la ubicación específica del sitio, y diseñar cebadores para el fragmento del exón de 150-200 pb aguas arriba y aguas abajo. del sitio. , incluido este sitio. Además, a pesar de la aparición de NGS, la secuenciación de Sanger sigue siendo un método muy económico y eficiente para detectar genes causantes de enfermedades genéticas de un solo gen con sitios causales claros y limitados. Hasta la fecha, la secuenciación de Sanger sigue siendo el estándar de oro para las pruebas genéticas y el método principal para la verificación del control normal e intrafamiliar después de las pruebas genéticas NGS.
Cabe destacar que el propósito de la secuenciación de Sanger es encontrar mutaciones genéticas específicas asociadas con enfermedades. Aunque la secuenciación de Sanger tiene una alta precisión analítica, su precisión depende del instrumento de secuenciación y de la configuración de las condiciones de secuenciación. Además, la secuenciación de Sanger no puede detectar tipos de mutaciones como grandes eliminaciones o variaciones en el número de copias, por lo que no es posible realizar un diagnóstico genético de algunas enfermedades genéticas relacionadas con ellas.
1.2 El método de análisis de ligamiento utiliza secuenciación indirecta
Antes de la aparición de NGS, la estrategia comúnmente utilizada para clonar loci de genes de enfermedades en el mundo se basaba en el escaneo de genes completos a gran escala y Análisis de ligamiento para clonar y posicionar genes. Los cromosomas humanos aparecen en pares, uno del padre y otro de la madre. Cada par de cromosomas tiene el mismo gen en la misma posición, pero sus secuencias no son exactamente iguales y se denominan alelos paternos y maternos.
Los marcadores genéticos son secuencias de ADN que exhiben polimorfismos en una población y pueden rastrear cualquier rasgo genético transmitido a través de un cromosoma, segmento cromosómico o locus genético en una familia. Está presente en cada individuo pero varía en tamaño y secuencia, es hereditario e identificable. Los marcadores genéticos de segunda generación actualmente en uso se denominan polimorfismos de secuencia repetida, específicamente repeticiones cortas en tándem, también conocidas como marcadores de microsatélites.
El análisis de ligamiento es un método de estudio de la relación entre genes causantes de enfermedades y marcadores genéticos, basado en un fenómeno genético llamado ligamiento.
Si existe un marcador genético cerca de un gen que controla un rasgo fenotípico, entonces se puede utilizar si existe una relación de vinculación entre el marcador genético y el gen propuesto y la cercanía de la relación de vinculación para ubicar el gen en una determinada ubicación cromosómica. En 1986, Morton et al. propusieron el método de densidad logarítmica dominante (LOD), que se utiliza principalmente para probar la relación de vinculación entre dos genes bajo una determinada tasa de recombinación. También se denomina marcador de microsatélite. Un valor LOD positivo admite el encadenamiento y un valor LOD negativo niega el encadenamiento. Al calcular el valor LOD entre los marcadores microsatélites y los loci que causan enfermedades en una familia, se puede estimar inicialmente la distancia genética y el grado de vinculación entre los dos, determinando así la ubicación aproximada del gen en el cromosoma. Luego utilice el mapa de genes cromosómicos de la región para analizar la función y expresión de todos los genes en la región de ubicación, seleccione los genes candidatos apropiados para la detección de mutaciones y, finalmente, localice o clone el gen que causa la enfermedad.
Sin embargo, el uso del análisis de ligamiento para pruebas genéticas tiene limitaciones importantes. No solo requiere una gran cantidad de muestras genéticas y generalmente requiere muestras de sangre de tres o más generaciones de pacientes, sino que también tiene una gran cantidad de datos, procesamiento complejo, velocidad de salida lenta y posicionamiento inexacto (generalmente solo se puede ubicar en un determinado intervalo de cromosomas). Investigación El trabajo es arduo y el tiempo necesario para localizar genes es extremadamente largo. Actualmente, todavía se utilizan polipéptidos de un solo nucleótido y repeticiones cortas en tándem para el análisis de ligamiento, pero en los Estados Unidos se han ido eliminando gradualmente los métodos clásicos de secuenciación indirecta, como los polipéptidos conformacionales monocatenarios, la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y el análisis de heterodúplex. , pero todavía tiene un uso limitado como herramienta de investigación en los países en desarrollo.
2. Secuenciación de próxima generación (NGS)
Incluye principalmente la secuenciación del genoma completo (WGS), la secuenciación del exoma completo (WES) y la secuenciación de regiones específicas (TRS), que pertenece a la siguiente generación. tecnología de secuenciación de generación. En general, la tecnología NGS tiene las ventajas de un alto rendimiento, poco tiempo, alta precisión y rica información, lo que permite a los genetistas localizar con precisión genes de interés en poco tiempo. Sin embargo, estas diferentes tecnologías de secuenciación varían mucho en términos de rango de secuenciación, cantidad de datos analizados, costo de secuenciación y tiempo. Si se elige un método adecuado, el diagnóstico clínico y la investigación científica serán más eficaces y con el doble de resultados.
2.1 La tecnología comúnmente utilizada para la secuenciación de la región objetivo es la tecnología de chip genético.
El principio de secuenciación se basa en el principio de hibridación del ADN, utilizando sondas personalizadas de la región genómica objetivo para hibridar con el ADN genómico. chips o hibridación en solución, enriquecen el ADN de la región del gen objetivo y luego lo secuencian mediante tecnología NGS. El proceso de secuenciación implica colocar decenas de miles de ADNc u oligonucleótidos en un chip para formar una matriz, y el emparejamiento complementario de sondas de nucleótidos de secuencia conocida fijadas en el chip con las correspondientes secuencias de ácido nucleico que contienen etiquetas fluorescentes en la solución. de la red se obtiene en función de la posición y la intensidad de la fuerte fluorescencia mostrada por el secuenciador, y luego la composición de la secuencia del nucleótido objetivo se determina utilizando un algoritmo bioinformático. La región diana seleccionada para la secuenciación puede ser una secuencia de ADN contigua o un fragmento distribuido en diferentes regiones del mismo cromosoma o en diferentes cromosomas. La tecnología de secuenciación de regiones dirigidas es un buen medio para detectar aún más mutaciones que se han descubierto previamente mediante análisis de ligamiento pero que no se pueden determinar dentro de la región del fragmento cromosómico. En 2010, Nicholas et al. identificaron con éxito el nuevo gen de la microcefalia WDR62 combinando matrices de genotipado con análisis de ligamiento. El artículo fue publicado en la revista NatGenet. Estudios similares también identificaron ocho loci de genes candidatos para el cáncer de páncreas familiar y un gen de susceptibilidad TSPAN12 para la vitreorretinopatía exudativa familiar.
La secuenciación de chips genéticos puede realizar investigaciones en profundidad sobre genes o regiones específicas objetivo del análisis de asociación o la detección del genoma completo, y es un medio eficaz para resolver el problema de los genes causantes de enfermedades que no se detectan mediante el análisis de asociación. . La tecnología de chips genéticos es un medio eficaz para resolver el problema de la imposibilidad de descubrir genes que causan enfermedades mediante el análisis de ligamiento. La tecnología de chips genéticos tiene ventajas obvias en la detección de mutaciones genéticas conocidas y puede detectar de forma rápida y completa mutaciones genéticas diana. Al mismo tiempo, debido al área objetivo limitada, el rango de secuenciación se reduce considerablemente y el tiempo y el costo de secuenciación también se reducen en consecuencia. Sin embargo, las pruebas de chips genéticos requieren una gran cantidad de ADN y, dado que el ADN extraído corre riesgo de degradación, es mejor utilizar sangre completa congelada como muestra de sangre para la investigación de chips genéticos, a fin de garantizar completamente la cantidad de ADN utilizada para pruebas.
2.2 Secuenciación del exoma completo (WES)
El exoma es la suma de todas las secuencias codificantes de proteínas del ADN genómico de un único individuo. Las secuencias del exoma humano representan aproximadamente el 1% de la secuencia total del genoma humano, pero contienen aproximadamente el 85% de las mutaciones que causan enfermedades. WES es un método de análisis genético que utiliza tecnología de captura de secuencias para capturar y enriquecer el ADN de regiones enteras del exoma, seguido de una secuenciación de alto rendimiento. Las principales plataformas tecnológicas utilizadas son el sistema de captura de exoma completo SeqCapEZ de Roche, la tecnología Solexa de Illumina y el sistema de enriquecimiento de secuencia dirigida a exones SureSelect de Agilent. El proceso de secuenciación NGS incluye principalmente la preparación, el anclaje y la unión de la biblioteca de secuenciación de ADN, la amplificación por PCR, la secuenciación de extensión de una sola base y el análisis de datos. A partir de los fragmentos de bases mezclados con diferentes etiquetas fluorescentes capturadas por el secuenciador durante el proceso de secuenciación, los investigadores utilizaron computadoras para convertir las señales fluorescentes en imágenes de picos de secuenciación y secuencias de bases de diferentes colores. Los resultados de la secuenciación de genes se comparan con bases de datos autorizadas internacionales, como la base de datos SNP del NCBI y la base de datos Thousand Genomes, para determinar en última instancia si el gen ha mutado.
Desde la llegada de la tecnología NGS, se han logrado resultados sin precedentes utilizando WES para identificar genes que causan enfermedades clínicas. Estos resultados no solo se centraron en enfermedades genéticas de un solo gen, sino que también encontraron una gran cantidad de genes relevantes en enfermedades complejas con influencias poligénicas. Se han descubierto nuevos genes o nuevas mutaciones en genes conocidos en enfermedades de un solo gen como la retinosis pigmentaria y la displasia ósea terminal. Se han descubierto nuevos genes causantes de enfermedades raras como el síndrome de Kaboki, la hipolipidemia mixta familiar y el trastorno del embarcadero espinocerebeloso. También se han obtenido resultados fructíferos en el estudio de tumores como el cáncer de pulmón de células pequeñas y la leucemia linfocítica crónica, así como de enfermedades complejas como la obesidad y la displasia cortical cerebral.
En comparación con otras tecnologías de secuenciación, la tecnología WES tiene ventajas obvias en el alcance de la detección y la tasa de detección. Por ejemplo, WES se puede utilizar para una mayor detección genética e identificación de muestras que no se pueden detectar mediante la secuenciación de Sanger y la secuenciación de chips genéticos. En comparación con los métodos tradicionales de secuenciación de regiones de codificación como Sanger, la aplicación de la tecnología WES puede lograr una cobertura más profunda y datos más precisos. Debido al aumento sustancial en la cantidad de información, WES puede obtener más información de regiones codificantes individuales, convirtiéndose así en un medio eficaz para detectar loci de genes que causan enfermedades y loci de genes de susceptibilidad. En comparación con el método de mapeo de análisis de ligamiento, WES no tiene requisitos muy estrictos para las familias. En enfermedades genéticas de un solo gen, dos o tres pacientes y una persona normal en la misma familia pueden identificar el gen causante sin la necesidad de tres generaciones continuas. familia genética. Al no requerir más de tres generaciones de rigurosos pedigríes genéticos, WES hace posibles estudios familiares que antes eran imposibles. No sólo es una buena herramienta de investigación para enfermedades genéticas de un solo gen, sino que también puede realizar estudios comparativos a gran escala sobre muchas enfermedades comunes como los tumores y la diabetes.
2.3 Resecuenciación del Genoma Completo (WGS)
WGS consiste en secuenciar el genoma completo de diferentes individuos de especies con secuencias genómicas conocidas, luego empalmar y ensamblar las secuencias, y obtener el genoma a través de análisis de datos El mapeo, o secuenciación de diferentes tejidos, es un método de investigación que analiza mutaciones somáticas. Aunque WES puede identificar rápida y exhaustivamente todas las mutaciones en el genoma de un individuo, descubriendo así diferencias interindividuales, no puede detectar genes de forma eficaz en regiones más allá de los exones. Para esta situación, actualmente se encuentran disponibles pruebas de genoma completo con la ayuda de WGS. Sin embargo, debido a que el genoma humano es demasiado grande, es difícil lograr la profundidad de secuenciación requerida en una secuenciación del genoma completo. Por lo tanto, se requiere una secuenciación repetida o una secuenciación de extremos emparejados, lo que da como resultado un aumento significativo en los costos de secuenciación y reduce la precisión de los resultados porque no se puede lograr una profundidad de secuenciación suficiente. Para el diagnóstico clínico de enfermedades y la investigación general, el alto costo de las pruebas es inasequible. No obstante, todavía se necesita WGS para pruebas genéticas más completas para algunos temas de investigación clínica y científica que no pueden ser abordados por WES.
3. Perspectivas
La aparición de NGS ha añadido infinita vitalidad e imaginación a las tecnologías genómicas emergentes. En particular, es alentador el advenimiento de los chips genéticos y su vitalidad en aplicaciones clínicas en la detección de enfermedades y el diagnóstico genético a gran escala, así como sus modelos de desarrollo comercial. La oftalmología es la disciplina más común de enfermedades de un solo gen. En el campo de la oftalmología, el uso de tecnología de chips para detectar la enfermedad de la rabia ha diagnosticado claramente muchas atrofias ópticas con causas desconocidas.
El glaucoma primario de ángulo abierto es la enfermedad ocular que causa ceguera más insidiosa y peligrosa en oftalmología. La identificación de sus genes o mutaciones causantes tendrá un valor clínico muy importante y un enorme valor comercial en la detección de enfermedades. La aplicación de la tecnología de chips genéticos en la detección de diabetes en recién nacidos puede ser más rápida, más completa y más económica, evitando los inconvenientes de ser demasiado engorrosa y perder la detección en la tecnología de secuenciación de primera generación.
La tecnología de chips genéticos tiene perspectivas de aplicación más amplias en el diagnóstico prenatal. Las enfermedades genéticas se pueden detectar simplemente realizando análisis de sangre de ADN en mujeres embarazadas, evitando las limitaciones y riesgos de las pruebas invasivas mediante amniocentesis para extraer líquido amniótico en el pasado. En la actualidad, con la mejora de la tecnología de pruebas genéticas y la reducción continua de los costos de las pruebas, será posible realizar pruebas genéticas individualizadas a gran escala en un futuro próximo. Al mismo tiempo, con el profundo desarrollo de las pruebas de genes de susceptibilidad a medicamentos y de genes de susceptibilidad a enfermedades, también se realizará una medicina personalizada basada en pruebas genéticas. Hay motivos para creer que a medida que el nivel de vida y la concienciación sobre la salud de las personas sigan mejorando, las pruebas genéticas tendrán un gran potencial en el desarrollo futuro de aplicaciones médicas.