Ayuda: ¿Cómo diseñar una sonda experimental EMSA?

1) ¿Qué es la prueba de migración en gel o prueba de migración electroforética?

El análisis de migración en gel o movilidad electroforética (EMSA) es una técnica de análisis cualitativo y cuantitativo para estudiar las interacciones de las proteínas de unión al ADN y sus secuencias de unión al ADN relacionadas. Esta técnica, que originalmente se utilizaba para estudiar las proteínas de unión al ADN, ahora se ha utilizado para estudiar la interacción de las proteínas de unión al ARN con secuencias de ARN específicas.

Las proteínas purificadas y los extractos celulares crudos generalmente se inmovilizan con sondas de ADN o ARN marcadas con isótopos 32P, y los complejos y las sondas no unidas se separan en electroforesis en gel de polipropileno nativo. Las sondas marcadas isotópicamente están disponibles como bicatenarias o monocatenarias, según la proteína de unión que se estudie. Para detectar proteínas de unión al ADN, como reguladores transcripcionales, se pueden utilizar proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas o extractos de células nucleares. Cuando se detectan proteínas de unión a ARN, se pueden utilizar proteínas purificadas o parcialmente purificadas, así como extractos nucleares o citoplasmáticos, dependiendo de la ubicación de la proteína de unión a ARN de interés. Se pueden utilizar fragmentos de ADN o ARN, así como fragmentos de oligonucleótidos que contienen secuencias de unión a proteínas (específicas) y otros fragmentos no relacionados (no específicos) en experimentos de competición para determinar la especificidad de las proteínas de unión a ADN o ARN. En presencia de fragmentos competitivos específicos y no específicos, la unión específica se determina en función de las características y la fuerza del complejo.

2) ¿Qué reactivos se necesitan para realizar un experimento de este tipo?

Las proteínas de unión necesarias para los experimentos de cambio de gel pueden derivarse de proteínas purificadas o parcialmente purificadas o de extractos nucleares y citoplasmáticos crudos. Normalmente, las sondas de nucleótidos de ADN están marcadas en sus extremos con polinucleótido quinasa g-32P y T4, y el ARN marcado isotópicamente se sintetiza in vitro utilizando ARN polimerasa de bacteriófago y nucleótidos marcados isotópicamente. El sistema Riboprobe®/sup de Promega (a, b) (n.º de catálogo: P1420, P1430, P1440, P1450 y P1460) se puede utilizar para sintetizar ARN marcado con isótopos in vitro, y el sistema de etiquetado de extremo 5` de ADN (Cat. No.: U2010) se puede utilizar in vitro. Síntesis de ARN marcado isotópicamente. Los componentes necesarios para la reacción de unión incluyen: solución salina (MgCl2, NaCl o KCl), sistema tampón (Tris-HCl o HEPES), agente reductor (DTT), glicerol, ADN competidor no específico (poli(dI:dC). dI : dC) y también puede contener detergentes no iónicos. Después de que las proteínas de unión y las sondas marcadas con isótopos se ejecutan en electroforesis en gel de polipropileno no desnaturalizante, los complejos se separan y posteriormente el gel se seca y se somete a autorradiografía o análisis con PhosphorImage.

3) ¿Qué reactivos se proporcionan con el sistema de análisis de desplazamiento de gel?

El sistema de análisis de desplazamiento de gel proporcionado por Promega se utiliza para detectar proteínas de unión al ADN y puede utilizarse como control positivo para este tipo de pruebas. El sistema central (número de catálogo: E3050) consta de un extracto de E. coli que contiene proteína AP2 recombinante (extracto de AP2) y un oligonucleótido homólogo de AP2 obtenido de E. coli que expresa la proteína AP2 extraída. Además, el sistema central contiene oligonucleótidos homólogos de SP1, tampón de unión por desplazamiento de gel (5') y extractos nucleares de HeLa para 20 experimentos de control. El sistema completo (número de catálogo: E3300) también contiene cinco oligonucleótidos bicatenarios adicionales que son homólogos a los sitios de unión AP1, OCT1, CREB, NF-kB y TFIID. Estos oligonucleótidos se pueden utilizar como sondas específicas después del marcaje final o como sondas no específicas en experimentos de competición. Para obtener más información, consulte el Manual técnico TB110 del experimento de cambio de gel.

4) ¿Qué factores deben optimizarse para realizar con éxito experimentos de cambio de gel?

El experimento de cambio de gel es simple y rápido en teoría, pero para realizarlo con éxito, es necesario optimizar algunos parámetros. Estos parámetros se ven afectados principalmente por la fuente de la proteína de unión y la proteína de unión. Características del sitio de unión de la sonda. Los factores que deben optimizarse son los siguientes: preparación de la solución de extracción (la contaminación por nucleasa y fosfatasa degradará la sonda), concentración de la proteína de unión, concentración de la sonda, concentración de la sonda no específica, fórmula del tampón y valor de pH, polipéptido. Características de la electroforesis en gel acrílico y condiciones de electroforesis, tiempo y temperatura de incubación, presencia o ausencia de proteínas transportadoras y cofactores (como zinc, cadmio y otros iones u hormonas metálicas). En general, el volumen total de reacción debe ser mínimo (20 ml). Para requisitos generales, el tampón de unión contiene 4 m de glicerol, 1 mMMgCl2, 0,5 mMEDTA, 0,5 mMDTT, 50 mMNaCl, 10 mMTris-HCl (pH 7,5), 0,05 mg/ml de poli(dI:dC)?dI:dC o 10 mMHEPES (pH 7,9). 50 mMKCl, 1 mMDTT, 1 mMEDTA, 10 glicerol y 0,05 mg/ml de poli(dI:dC). Para obtener más información, consulte el "Manual técnico del experimento de cambio de gel" TB110.

5) ¿Qué cebadores polinucleotídicos homólogos se proporcionan y cuál es la fuente de secuencia de estos cebadores?

Existen varios tipos de sondas de ADNds que contienen sitios de unión homólogos para diversos reguladores transcripcionales. La siguiente tabla enumera las sondas disponibles y las fuentes de secuencia para estos cebadores.

Sonda reguladora transcripcional

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Nombre de la sonda Número de catálogo Secuencia (enlace ascendente) Fuente de secuencia

Sp1 E3231, E3232 5`-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG -3 ` Promotor SV40 (1)

AP1 E3201 E3202 5`-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3` Gen colagenasa TRE (2)

AP2 E3211 E3212 5`- GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3` Metalotiazida II a(3) humana

Gen NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3` Gen de cadena ligera Igk de ratón (4)

Oct1 E3241 E3242 5`-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3`Ig gen de cadena pesada (5)

CREB E3281 E3282 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3` gen inhibidor de la hormona de crecimiento de rata (6)

TFIID E3221 E3222 5`-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3` belta -1 Promotor de globulina

Sólo se enumera la secuencia de la cadena superior; la sonda es de doble cadena y las secuencias de la cadena superior e inferior están emparejadas. El texto en negrita indica que la secuencia se deriva de la secuencia genética indicada y las secuencias a las que se unen los reguladores transcripcionales están subrayadas. En general, los nucleótidos circundantes son arbitrarios.

6) ¿Cuáles son los factores importantes a considerar al elegir una sonda de ADN?

El ADN objetivo debe tener menos de 300 pb de longitud para facilitar la separación electroforética de sondas no unidas y complejos proteína-ADN. Se pueden utilizar oligonucleótidos sintéticos de doble cadena y secciones de enzimas de restricción como sondas en experimentos de cambio de gel.

Si se ha identificado la proteína diana, se deben utilizar fragmentos de oligonucleótidos cortos (aproximadamente 25 pb) para distinguir el sitio de unión del de otros factores. Se pueden usar fragmentos largos de enzimas de restricción para localizar sitios de unión a proteínas dentro de supuestas regiones promotoras/potenciadoras. Luego se pueden analizar regiones específicas de unión a proteínas a nivel de secuencia de ADN mediante transferencia de ADNasaI.

7) ¿Cuál de los siguientes reguladores transcripcionales forma complejos con extractos nucleares de células HeLa? AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB.

Cuando el extracto nuclear de células HeLa se utiliza como fuente de proteínas de unión, cada regulador transcripcional se une a su secuencia homóloga de ADN asociada para formar un patrón de unión característico. Cada regulador transcripcional se describe a continuación, incluidas las secuencias homólogas identificadas, el tamaño del factor, las condiciones de unión específicas y la cantidad de complejos que se pueden formar con extractos nucleares de HeLa.

1.AP1: AP1 (proteína activadora 1) es un regulador transcripcional que se une a la secuencia homóloga 5`-TGAGTCA-3`. Los genes se inducen cuando los sitios de unión de AP1 están presentes en sus regiones promotoras, por ejemplo, la proteína quinasa C es inducida por forboéster (2,7). En las células, AP1 forma homodímeros con c-Jun o proteínas relacionadas con Jun o heterodímeros con c-Jun o proteínas relacionadas con Jun y c-Fos o antígeno relacionado con Fos (Fras). La proteína Fos en sí no puede formar homodímeros y no puede unirse sola al sitio de unión AP1. La proteína c-Jun es una proteína monomérica de 40 kDa que forma un homodímero mediante una cremallera de leucina. En las células HeLa, la forma predominante de AP1 es un homodímero de la proteína c-Jun, que forma complejos específicos en ensayos de cambio de gel. Cuando se utiliza como ensayo de cambio de gel para determinar la actividad de AP1, se deben agregar 0,01 mg/ml de poli(dI:dC)?dI:dC, 100 µg de BSA, 5 mMDTT al tampón de unión además de los componentes básicos de la solución. Si usa proteína purificada, use 1-2ug de proteína para detectar complejos migratorios.

2.AP2: AP2 es un regulador transcripcional que actúa como inductor de TPA y AMPc, respectivamente (10). Es una proteína de 52 kDa que reconoce la secuencia homóloga 5`-CCCCAGGC-3` o 5`-GCCNNGGC-3` (3). Este factor es particularmente sensible al ácido retinoico y puede desempeñar un papel importante en la morfogénesis. Los extractos nucleares de células HeLa forman complejos específicos con sondas de ADN homólogas de AP2. Al realizar experimentos de cambio de gel con proteína purificada, utilice entre 20 y 50 ng de proteína.

3.CREB: CREB es un regulador transcripcional de 37 kDa que responde al AMPc y reconoce la secuencia homóloga del ADN 5`-T(G/T)ACGTCA-3` (6, 11). Forma homodímeros a través de una estructura que contiene cremallera de leucina, y el dominio básico asociado es homólogo al dominio de unión c-JunDNA. Cuando se utiliza con extractos nucleares de células HeLa, forma complejos con secuencias homólogas de CREB.

4.NF-kB: NF-kB se identificó originalmente como de unión al potenciador de la cadena ligera k de inmunoglobulina en las células B. Sin embargo, más tarde también se encontró NF-kB en el citoplasma de células no B y formó un complejo de NF-kB e IkB. NF-kB se aísla inicialmente en un complejo proteico de unión al ADN como un heterodímero compuesto de p65 (RelA) y p50. Otros monómeros aislados incluyen p49 (también conocido como p52), p75 (c-Rel) y p68 (RelB).

Los monómeros p65, p68 y p75 son transactivadores. Se ha informado que p49 y p65 (un monómero de NF-kB) forman un heterodímero con una actividad transcripcional similar a la del heterodímero p50/p65. La unión de los monómeros IkB y p65 bloquea su localización en el núcleo y su unión al ADN. Altas concentraciones de p65 in vitro forman homodímeros que se unen débilmente al ADN, y el poli(dI:dC) inhibe esta reacción (14). Normalmente, al realizar experimentos de migración en gel de NF-kB, agregue 0,28 pmol de oligonucleótido NF-kB9 (pH 7,9) a un volumen de reacción de 20 ul, disuelto en HEPES 10 mM, KCl 50 mM, MEDTA 0,2 mM, 2,5 DTT 10 mM, glicerol 10 y 0,05 NP-40. Cuando se utiliza proteína purificada, 250-300 nanogramos son suficientes para los ensayos de cambio de gel. Cuando se utiliza proteína purificada, 300 ng son suficientes para formar complejos de desplazamiento de gel, mientras que se requieren 10 ug de extracto nuclear de HeLa. Los complejos desplazados en gel se mantuvieron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se separaron mediante electroforesis en un gel de 7-poliacrilamida que contenía Tris 50 mM (pH 8,3) y glicina 38 mM. Las soluciones enriquecidas que contienen colorantes azul de Coomassie y azul de xileno solo deben agregarse a reacciones de control negativo porque estos dos colorantes pueden exacerbar la disociación del complejo NF-kB. Cuando se utilizan extractos nucleares de células HeLa como fuente de proteína de unión, se forman dos complejos de desplazamiento de gel específicos de secuencia, a saber, el homodímero p50/p50 y el heterodímero p50/p65. En las células que expresan p49, p50 y p65, se detectan cuatro complejos desplazados en gel específicos de secuencia (p49/p49, p50/p50, p50/p65, p49/p65) y, si están presentes altas concentraciones de p65, se detectan trazas de Se puede detectar p65/p65. Los siguientes reactivos mejoran la unión de NF-kB in vitro: GTP mM, ATP, espermina, iones de bario o calcio, ng de Co 3 (NH3) 6 (12).

5.OCT1OCT1 es un miembro de la familia de reguladores transcripcionales OCT, que aparentemente está más extendida en células de mamíferos (5). El dominio POU incluye los dominios POU-box y Homeo. Cuando se utilizaron extractos nucleares de células HeLa, se detectaron complejos desplazados en gel de secuencia homóloga formados por sondas homólogas a OCT1.

6.SP1: SP1 es un regulador transcripcional O-glicosilado que reconoce la secuencia homóloga de 10 nucleótidos de longitud 5`-GGGGCGGGGC-3` (1). La secuencia de reconocimiento central es 5`-GGGGCGGGG-3`. A menudo se encuentran secuencias similares a la secuencia central en los promotores, como el promotor temprano de SV40, que es el primer promotor capaz de unirse a SP1. Tiene un peso molecular de 95-105 kDa (dependiendo del grado de glicosilación) y tres huellas digitales de zinc en el dominio de unión al ADN determinan la especificidad de la secuencia. El extracto nuclear de células HeLa forma complejos de desplazamiento de gel específicos con la sonda de homología SP1.

7.TFIID/TFIIB: TFIID y TFIIB son importantes reguladores transcripcionales implicados en la transcripción básica del promotor de la ARN polimerasa II (16). TFIID forma una unión de ADN específica a la región TATA de promotores eucarióticos. Otros componentes proteicos de TFIID se denominan factores asociados a TBP (TAF). Utilizando oligonucleótidos de sonda TFIID y extractos nucleares de células HeLa, se obtuvo una débil banda desplazada en gel, pero fue difícil identificarla como un complejo desplazado en gel específico de la secuencia TFIID.

Es difícil realizar experimentos de cambio de gel con TBP recombinante purificado, en parte porque el TBP lleva una fuerte carga positiva, lo que dificulta que el complejo TBP/ADN entre en el gel. La TBP purificada no puede unirse al ADN cuando forma dímeros (17). Por tanto, los dímeros formados pueden participar en la unión al ADN. TFIIB por sí solo no se une al ADN, pero la unión a TFIID mejora su unión al ADN.

TFIIB se une al complejo de preiniciación, permitiendo que la ARN polimerasa II y TFIIF se unan a la región de inicio de la transcripción. Por tanto, TFIIB juega un papel importante en la formación del complejo de preiniciación. Al realizar experimentos de cambio de gel con TFIID purificado, no es necesario agregar poli(dI-dC) a la reacción de unión. El tampón de unión contiene 10 m de glicerol, 20 mMTris (pH 8,0), 10 mMMgCl2, 2 mMDTT, 89 mMKCl. Al realizar experimentos de unión de gel con TFIID, se puede agregar poli(dG:dC) ?dG:dC. Los complejos formados se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante con la siguiente composición de gel: 0,5' TBE, 6 gel de poliacrilamida (acrilamida 19:1: bifurcada), 4 mMMgCl2, 0,02 NP-40, electroforesis. La composición del tampón es: 0,5'TBE, 4 mMMgCl2. , 0,02 NP-40: Al estudiar complejos que contienen TFIID y TFIIB, se debe eliminar el MgCl2 del tampón de unión, del gel y del tampón de electroforesis. Los anteriores son requisitos generales al realizar experimentos de cambio de gel utilizando diferentes extractos celulares para formar complejos con TFIID y TFIIB, se deben optimizar varios factores para lograr las condiciones ideales.

8) ¿Cuánta proteína o extracto y sonda de ADN marcada se utilizan en el experimento de cambio de gel?

Para cada sonda y proteína de unión específica, es necesario optimizar la cantidad de proteína purificada, proteína parcialmente purificada y extracto nuclear crudo. En términos generales, la cantidad de proteína purificada está entre 20 y 2000 ng, y la proporción equimolar de proteína a ADN se puede ajustar a 5 veces los moles de proteína por moles de ADN. Para los extractos nucleares crudos, se requieren de 1 a 20 µg de proteína para formar complejos específicos. La cantidad de sonda añadida en la reacción es de 50.000 a 200.000 cpm de sonda marcada con 32P (alta actividad específica) y el volumen de reacción es de 1 a 5 ul. Esto corresponde a 10-50 fmoles de sonda de ADN. Las sondas deben almacenarse a -20 °C para evitar la degradación y deben usarse dentro de 1 a 2 semanas después de la síntesis o el etiquetado. Se deben evitar múltiples congelaciones y descongelaciones de sondas o proteínas de unión.

9) ¿Se puede preparar la proteína diana mediante traducción in vitro?

Promega no realiza traducción in vitro de todos los reguladores transcripcionales. Generalmente, la traducción in vitro de factores de transcripción de células de mamíferos o proteínas de unión al ADN utiliza extracto de germen de trigo, mientras que los lisados ​​de reticulocitos de conejo pueden contener factores de transcripción de células de mamíferos endógenos o proteínas de unión al ADN. Sin embargo, el sistema de lisado de reticulocitos de conejo TNT®/supgt (a, b, c, d) utilizado con ARNt marcado con biotina TranscendTM (n.º de catálogo E3201) para el regulador transcripcional traduccional AP1 (c-Jun) permitió el oligonucleótido homólogo de AP1. (Cat. No. E3201) produce el mismo efecto. 18) TNT?/supgt; extractos de germen de trigo acoplados a T7 (b,c,d,e) traducen in vitro c-Rel, una proteína que provoca específicamente la migración de la sonda potenciadora de la cadena ligera de inmunoglobulina K. La adición del miembro MAD-3 del grupo de la familia IkB traducido in vitro a la reacción de unión de c-Rel interfiere con su interacción.

10) ¿Cuáles son las funciones del poli(dI:dC), del ADN competitivo no específico y del ADN competitivo específico?

Está compuesto por inosina y citosina.

Debido a su estructura especial, puede inhibir la unión no específica de proteínas y sondas marcadas y evitar falsos complejos. La adición de poli(dI:dC) a la reacción de desplazamiento del gel inhibe la unión no específica de otras proteínas de unión al ADN, como los reguladores transcripcionales, en extractos nucleares crudos. Al realizar reacciones de cambio de gel con proteínas purificadas, no es necesario agregar poli(dI:dC); si se agrega, la concentración final utilizada en reacciones comunes no excede los 50-100 ng; Para extractos nucleares, utilice 1 ug de poli(dI:dC)?dI:dC) por 2-3ug de extracto nuclear. Para determinar la especificidad del complejo formado, se pueden realizar experimentos competitivos de la reacción de unión con o sin la adición de ADN competidor específico no radiactivo o ADN competidor no específico. En general, el ADN específico no radiactivo es una sonda de ADN no marcada, mientras que el ADN competidor no específico tiene la misma composición de longitud que la sonda de ADN pero una secuencia diferente. Un complejo que compite con ADN específico no radiactivo pero que no puede competir con ADN competidor no específico indica que la proteína objetivo se une específicamente a la sonda marcada isotópicamente. La unión no específica puede ser eliminada por competencia mediante ADN específico y ADN competidor no específico. Es necesario optimizar la cantidad de poli(dI:dC)?dI:dC) en la solución de unión, pero normalmente se utiliza 0,05 mg/ml. La cantidad de ADN competidor no radiactivo (específico o no específico) también debe optimizarse o titularse, pero la cantidad de ADN competidor suele ser de 10 a 1000 veces (p/p) la de la sonda marcada isotópicamente. Otros tipos de ADN competidor, como el ADN del timo de ternera, no se pueden utilizar en reacciones de cambio de gel; llevan sitios de unión para la proteína objetivo.

11) ¿En qué condiciones de gel se separan los complejos proteína/sonda y las sondas libres?

Las proteínas o extractos nucleares crudos unidos a sondas diana, complejos proteína/sonda y sondas libres se pueden separar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. La concentración de poliacrilamida suele ser 6 (relación acrilamida:biacrilamida 30:1), aunque se pueden usar concentraciones mayores o menores bajo ciertas condiciones. El pH, la concentración de poliacrilamida y la relación acrilamida:acrilamida de doble cabeza influyen en la migración compleja en el gel. Utilice 10-15 voltios para la mayoría de las proteínas, utilice ráfagas cortas de alto voltaje (30-35 voltios) para una disociación rápida de proteínas. El TBE y el TAE utilizados para la electroforesis deben estar recién preparados y libres de precipitados. La baja fuerza iónica y el "efecto caja" de la matriz de acrilamida ayudan a estabilizar el complejo. El tampón TGE (Tris 12,5 mM, pH 8,3, glicina 95 mM, MEDTA 0,5 mM) también se puede utilizar para complejos inestables de proteína/ADN. Los experimentos de unión y electroforesis se pueden realizar a 4oC para evitar complejos inestables y la disociación de la sonda. Los pigmentos en las soluciones de muestra enriquecidas pueden provocar la disociación de complejos inestables, por lo que se deben utilizar soluciones de muestra enriquecidas que no contengan azul de Coomassie ni azul de xileno. Cuando las bandas están sueltas y colas, esto indica una disociación compleja. El gel debe estar completamente polimerizado para evitar la formación de bandas. Si el complejo no logra ingresar al gel, se usa demasiada proteína o sonda, o la concentración de sal es demasiado alta para la reacción. Si no hay ninguna sonda libre o complejo en la banda que contiene el extracto, pero la sonda está presente en la banda que contiene solo la sonda, indica que el extracto está contaminado con ácidos nucleicos o fosfatasas, y se deben agregar cantidades apropiadas al extracto. y reacciones de unión. Los complejos proteína/sonda (Metaphor®/sup/agarosa) ahora se pueden separar en geles de agarosa de alta resistencia.

12) ¿Cómo determinar si una proteína está presente en un complejo específico?

Las proteínas parcialmente purificadas o los extractos nucleares crudos y sondas específicas pueden formar uno o más complejos proteicos específicos. La presencia de múltiples complejos indica degradación de proteínas, por lo que se deben agregar inhibidores de proteasa a la solución de extracción y a la reacción de unión. Identificar las proteínas del complejo puede resultar difícil, pero hay formas de hacerlo.

Si hay un anticuerpo contra la proteína objetivo, se puede realizar una prueba de superdesplazamiento. El anticuerpo se une a la proteína en el complejo proteína/sonda y retrasa la migración del complejo, lo que da como resultado un superdesplazamiento. Agregue cantidades cada vez mayores de anticuerpo a la reacción de unión. Se pueden agregar anticuerpos a la proteína y a la reacción de la sonda, o se pueden combinar extractos con anticuerpos y luego agregarlos a la sonda. Dependiendo del determinante antigénico específico del anticuerpo, el primero favorece la formación de complejos superdesplazados, mientras que el segundo previene la formación de complejos, lo que resulta en una reducción de la fuerza del complejo original. En la mayoría de los experimentos, los anticuerpos deben titularse a una proporción molar de anticuerpo a proteína de 1:1 y luego aumentarse según sea necesario. Si se dispone de proteína purificada, esto se puede comparar con complejos experimentales de migración de bandas. Además de los experimentos de supershift, las propiedades de las proteínas del complejo también se pueden analizar mediante reticulación UV y transferencia de etiquetas. Se reúnen sondas marcadas uniformemente y extractos nucleares, los complejos se entrecruzan mediante irradiación UV y las sondas desprotegidas se degradan posteriormente mediante DNasa. Dado que la DNasa elimina las etiquetas de las sondas marcadas en los extremos, se requieren sondas marcadas uniformemente. Las proteínas entrecruzadas con varios nucleótidos protegidos se separaron mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida, se secaron y se sometieron a autorradiografía. El peso molecular de las proteínas unidas se puede comparar con referencias moleculares estándar. Los complejos también se pueden analizar mediante transferencia Western con anticuerpos contra la proteína diana (20). Si una proteína se une a una secuencia específica de una sonda de ADN, se puede caracterizar utilizando oligonucleótidos competitivos que contienen secuencias de unión conservadas, así como mutantes. La formación de complejos también se puede estudiar mediante mutaciones dirigidas que alteran los sitios de unión en secuencias conservadas.

Referencias

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