Cómo utilizar correctamente el cromatógrafo líquido
1. La columna cromatográfica incluye columna vacía y empaque. La columna hueca es un tubo de acero inoxidable con una pared interior pulida, un diámetro interior de 4~5 mm y una longitud de 100~250 mm. Lavar la columna vacía según el método de lavado en cromatografía de gases y llenar la fase estacionaria con el método homogéneo. Instale la columna cromatográfica en la tubería del instrumento y utilice una bomba alternativa mecánica para inyectar la fase móvil recién desgasificada en la columna cromatográfica. Después de enderezar la línea base, se puede usar una mezcla de benceno, naftaleno y fenantreno, con n-hexano (que contiene 0,05 % de metanol) o metanol:agua (83:17) como fase móvil, y el número de placas en la Se determina que la torre está entre 20.000 y 30.000 placas/ml. Arriba, cuando la resolución es superior a 1,5, la eficiencia de la columna es buena. Para evitar la contaminación de la columna cromatográfica, a menudo se utiliza gel de sílice (40~50 mm) con una longitud de 50 mm y un diámetro interior de 4~5 mm delante de la columna principal para proteger la columna cromatográfica (precolumna) con el mismo Embalaje como columna cromatográfica para extender la vida útil de la columna cromatográfica. Después de usar una columna unida de fase reversa. Se debe hacer circular agua por completo para eliminar impurezas como sales, ácidos y álcalis, para evitar la oxidación en la columna cromatográfica y la acumulación de impurezas en el empaque, y luego lavar la columna cromatográfica con metanol para obtener la regeneración.
2. Después de desgasificar y eluir la fase móvil en la botella de almacenamiento de líquido, fluye hacia la bomba de alta presión a través del tubo de politetrafluoroetileno con un diámetro interior de 2 mm en el cabezal del filtro y ingresa a la columna cromatográfica. , y finalmente sale del detector o como líquido residual. Recoja o recicle. Los métodos de elución en fase móvil tienen elución con disolvente constante (elución isocrática), es decir, la proporción de disolventes es constante desde el principio hasta el final de la elución. La otra es la elución en gradiente, donde la polaridad del disolvente aumenta gradualmente durante la cromatografía. La relación de concentración de la fase móvil debe cambiarse continuamente de acuerdo con un determinado procedimiento, de modo que los componentes más pequeños y más grandes de la misma muestra puedan separarse bien en un proceso de cromatografía y también se acorte todo el proceso de cromatografía. Cabe señalar que el método de elución en gradiente no se puede utilizar para la cromatografía de exclusión por tamaño ni para la cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa con detección electroquímica.
3. Existen tres tipos de detectores adecuados para los detectores de concentración de fármacos en sangre: absorción ultravioleta, emisión de fluorescencia y electroquímica. Los detectores UV son adecuados para medicamentos que absorben la luz ultravioleta. La mayoría de las moléculas de los medicamentos absorben la luz ultravioleta, por lo que se pueden usar con mayor frecuencia. El límite de detección es de aproximadamente 0,1 μg. Los detectores UV incluyen tipos de longitud de onda fija, tipos de longitud de onda variable y escáneres. No solo pueden detener el flujo de la fase móvil y realizar una detección cualitativa y cuantitativa de componentes, sino que también mejoran la sensibilidad de la medición y tienen una buena reproducibilidad. Los detectores de emisión de fluorescencia sólo se pueden utilizar con fármacos que produzcan fluorescencia. En la década de 1980, se utilizó láser para reemplazar la fuente de luz de xenón y la intensidad de la luz aumentó de 3 a 4 veces. El límite de detección de algunas drogas puede alcanzar el nivel de pg. Los detectores electroquímicos son celdas electrolíticas de bushel hechas de lodo de carbón o carbón triturado. Se utiliza comúnmente para detectar catecolaminas y diversos fármacos y metabolitos con grupos fenólicos. El componente efluente ingresa a una celda electrolítica de capa delgada de 2 μl y se electroliza bajo un voltaje de ablandamiento para generar corriente, que se amplifica y detecta. El límite de detección es el nivel de pg.
4. Procesamiento de datos La cromatografía líquida de alto rendimiento moderna está equipada con un sistema de procesamiento de datos. Además de registrar espectros, también registra automáticamente el tiempo de retención de cada pico. Puede calcular automáticamente el área del pico de manera integral. y proceder de acuerdo con procedimientos predeterminados Realizar cálculos relevantes e informar los resultados de los análisis.
Problemas y soluciones comunes durante el uso de la cromatografía líquida de alta resolución
1 Sistema de cromatografía líquida
La cromatografía líquida consiste principalmente en botellas de almacenamiento de líquidos, bombas, Consta de inyector, columna cromatográfica, horno de columna, detector, sistema de procesamiento de datos, etc. (como se muestra en la Figura 1). Para todo el sistema, la columna cromatográfica, la bomba y el detector son los componentes principales y también son los principales lugares donde pueden ocurrir accidentes.
2 Problemas y soluciones comunes
2.1 Problema de presión de la columna (Tabla 1)
El problema de presión de la columna requiere mucha atención durante el uso de cromatografía líquida de alta resolución. Donde, la estabilidad de la presión de la columna está estrechamente relacionada con la forma del pico cromatográfico, la eficiencia de la columna cromatográfica, el efecto de separación, el tiempo de retención, etc. La llamada presión de columna estable no significa presión de columna estable. La llamada presión de columna estable no significa que el valor de la presión sea estable en un valor constante, sino que la presión fluctúa dentro de un rango de 50 PSI. Presiones demasiado altas, demasiado bajas y fluctuantes son todos problemas de presión de la columna, pero el nivel de presión de la columna está relacionado con el tipo y la marca de la columna, el sistema de fase líquida en sí y el tipo de fase móvil utilizada. Cabe señalar que cuando se utiliza elución en gradiente, se permiten cambios suaves y lentos en la presión de la columna de inyección.
En el funcionamiento real, el problema de la presión excesiva en la columna se puede considerar desde varios aspectos [1].
Primero considere si la columna está obstruida. En este momento, puede reemplazar la columna por una nueva para realizar pruebas.
2.2 Para la deriva del tiempo de retención [2, 3] (Tabla 2)
Los cambios en el tiempo de retención son un problema que a menudo encuentran muchos usuarios de cromatografía líquida, que incluye aumentos y disminuciones del tiempo de retención. Dos situaciones. Tiene que ver con muchas razones.
2.3 Problemas de picos anormales [2-4]
Los picos anormales se refieren a la ausencia de picos o la aparición de picos negativos, picos anchos, picos dobles, hombros y formas de pico asimétricas en el cromatograma y otros fenómenos. Consulte la Tabla 3 para situaciones específicas y análisis de causas.
3 Mantenimiento de HPLC [5-7]
3.1 Condiciones de funcionamiento diarias de HPLC
Temperatura de funcionamiento 10 ~ 30 ℃ Humedad relativa <80%; Lo mejor es tener temperatura y humedad constantes, lejos de equipos de alta interferencia eléctrica y vibración.
3.2 Mantenimiento de la bomba
Intente utilizar una fase móvil limpia como fase móvil; el cabezal del filtro con núcleo de arena en la entrada debe limpiarse con frecuencia para evitar la precipitación al cambiar la fase móvil; Obstrucción u obstrucción en la bomba Se producen burbujas.
3.3 Mantenimiento del inyector
Después de cada análisis, se debe enjuagar repetidamente la entrada para evitar la contaminación cruzada de la muestra.
3.4 Mantenimiento de columnas