El proceso, principios y métodos de construcción de bibliotecas genéticas.

Principios básicos y métodos de construcción 1.1 Biblioteca de ADNc

La biblioteca de ADNc se refiere al fragmento de ADNc formado mediante la transcripción inversa de todo el ARNm transcrito en un determinado período de desarrollo del organismo y una cierta colección de clones formados por ligación de un vector. El principio básico de la construcción de una biblioteca de ADNc clásica es utilizar Oligo (dT) como cebador de transcripción inversa o utilizar cebadores aleatorios para agregar adaptadores apropiados al ADNc sintetizado y conectarlo a un vector apropiado para obtener una biblioteca. Los pasos básicos incluyen: extracción de ARN (como el método de isotiocianato de guanidina, el método de disolvente orgánico de clorhidrato de guanidina, el método de fenol caliente, etc., y la elección del método de extracción depende principalmente de las diferentes muestras). Para construir una biblioteca de ADNc de alta calidad, es muy importante obtener ARNm de alta calidad, por lo que se debe tener cuidado al manipular muestras de ARNm. Dado que la RNasa está presente en todos los seres vivos y es resistente a entornos físicos como la ebullición, establecer un entorno libre de RNasa es muy importante para preparar ARN de alta calidad. Después de obtener ARNm de alta calidad, la cadena 1 de ADNc se sintetiza bajo la guía de la transcriptasa inversa Oligo (dT) y la cadena 2 de ADNc se sintetiza (utilizando ARNasa H y ADN polimerasa I de E. coli, incluido el uso de polinucleotidasa del fago T4). y reacción de reparación de ADN ligasa de E. coli). Agregue adaptadores sintéticos, clone el ADN bicatenario en el vector, analice el inserto de ADNc, amplifique la biblioteca de ADNc e identifique la biblioteca de ADNc establecida. El énfasis aquí está en la selección de vectores. El fago lambda se usa comúnmente porque el ADN lambda tiene extremos adhesivos de 12 nucleótidos en ambos extremos, que pueden usarse para construir plásmidos coseno y pueden acomodar grandes fragmentos de ADN extraño.

Biblioteca completa de ADNc 1.2

Aunque la construcción de bibliotecas de ADNc clásicas es eficaz y sencilla, los fragmentos clonados en la biblioteca son generalmente pequeños y los fragmentos de ADN de un solo clon son demasiado cortos para proporcionar suficiente información genética. Hay muy poca información. La mayoría de ellos requieren varios clones para cubrir el ADNc completo del gen completo. Para clonar ADNc verdadero de longitud completa, es de gran importancia establecer una biblioteca de ADNc de longitud completa. Por lo tanto, es necesario superar las limitaciones causadas por la síntesis de la cola de PolyA únicamente a partir de ARNm y las características de la transcriptasa inversa ordinaria. La biblioteca de ADNc de longitud completa se refiere a un grupo de moléculas de ADN obtenidas de un conjunto completo de moléculas de ARNm en el organismo mediante transcripción inversa, y es una copia completa del grupo de moléculas de ARNm. Las bibliotecas de ADNc de longitud completa no solo pueden proporcionar información completa de ARNm, sino también obtener información de empalme de ARNm mediante la comparación de secuencias de genes. Además, puede predecir secuencias de proteínas y expresarlas in vitro, y estudiar funciones genéticas mediante genética inversa. La construcción de bibliotecas completas actualmente reportadas se lleva a cabo generalmente según el método del kit de construcción de bibliotecas Smart cDNA de CLONTECH Company de los Estados Unidos o las instrucciones de uso del kit universal (Invitrogen, Estados Unidos). Existen varios métodos principales para determinar si la secuencia de ADNc en la biblioteca de ADNc es ADNc de gen de longitud completa.

1.2.1 Evaluar directamente desde la secuencia.

Extremo 5’: Si hay una comparación del gen homólogo de longitud completa, se puede juzgar comparándolo con el extremo 5’ del gen correspondiente conocido en otros organismos. Si no hay ningún gen nuevo con genes homólogos, primero determine si el marco de codificación está completo, es decir, si hay un codón de parada en el mismo marco aguas arriba del primer ATG en el marco de lectura abierto; en segundo lugar, determine si hay un codón de parada en el mismo marco aguas arriba del primer ATG en el marco de lectura abierto; punto de inicio de la transcripción, generalmente en la estructura de la tapa 5'. Si hay una región rica en pirimidina al final, o la secuencia 5' del ADNc es parcialmente idéntica a la secuencia del genoma protegido por digestión enzimática, entonces se puede determinar que el El extremo 5' del ADNc obtenido está completo. Extremo 3': también se puede juzgar comparando el extremo 3' de los genes correspondientes conocidos en otros organismos. O hay un codón de parada aguas abajo del marco de codificación, o hay más de 1 señal de cola PolyA, o hay una. Cola PolyA pero sin señal de cola obvia.

Prueba experimental 1.2.2.

Las longitudes de los extremos 5' y 3' se pueden determinar mediante métodos de extensión de cebadores, como RACE del extremo 5' y RACE del extremo 3', o se puede confirmar si los tamaños son consistentes mediante Northern Blot. .

Utilice 1.3 para analizar la biblioteca de ADNc

Hay dos aspectos principales para evaluar la calidad de la biblioteca de ADNc. El primer aspecto es la representatividad de la biblioteca. La representatividad de una biblioteca de ADNc significa que las moléculas de ADNc recombinante contenidas en la biblioteca reflejan la integridad de la información de expresión (es decir, el tipo de ARNm) en las células de origen. Este es el indicador más importante de la calidad de la biblioteca. La representatividad de una biblioteca se puede medir por la capacidad de la biblioteca, que es el número de clones recombinantes independientes contenidos en la biblioteca de ADNc original. El tamaño de la biblioteca depende del tipo de ARNm expresado en la célula fuente y del número de copias de cada secuencia de ARNm. 65,438 0 Las células normales contienen 65,438 00,000 ~ 30,000 tipos diferentes de ARNm, que se pueden dividir en tres tipos según su abundancia: abundancia baja, abundancia media y abundancia alta. El ARNm de abundancia baja se refiere a la proporción actual de un determinado tipo de. El ARNm en el grupo celular total es inferior a 0,5. La capacidad de una biblioteca de ADNc que cumple con los requisitos mínimos se puede calcular mediante la fórmula de Clack-Carbor N = ln(1-P)/(1-1/N) (P es la probabilidad de que haya información de secuencia de ARNm en la biblioteca , generalmente establecido en 99; n es el número mínimo teórico de clones recombinantes de cualquier secuencia de ARNm en la célula con probabilidad P en la biblioteca; n es el número de copias de la secuencia de ARNm más rara en la célula; todos los ARNm expresados ​​en la célula). El segundo aspecto es la integridad de la secuencia de los fragmentos de ADNc recombinante. Integridad de secuencia de varios fragmentos de ARNm expresados ​​en células. Aunque las secuencias específicas de varios ARNm expresados ​​en células son diferentes, se componen básicamente de tres partes, a saber, la región 5' no traducida, la región codificante media y la región 3' no traducida. Las características de la secuencia de la región no traducida desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica, y la secuencia codificante es el producto génico sintetizado: la proteína plantilla. Por lo tanto, para aislar y obtener la secuencia completa y la información funcional del gen diana de la biblioteca, se requiere que los fragmentos de ADNc recombinante en la biblioteca sean lo suficientemente largos para reflejar la estructura del gen natural tanto como sea posible.

2 Otros tipos de construcción de bibliotecas de ADNc

2.1 Biblioteca de ADNc homóloga

Se refiere a una biblioteca de ADNc en la que se encuentran todos los genes expresados ​​de un tejido o célula específica. incluido. El número de copias de ADNc correspondiente al gen expresado es igual o cercano al del gen expresado. WEISSMAN ha propuesto durante mucho tiempo la teoría de que las bibliotecas de ADNc pueden homogeneizarse mediante el principio de hibridación por saturación del ADN genómico. Pero esta teoría se ha considerado inaplicable en la práctica. El principal factor limitante es la dificultad para proporcionar suficiente ADNc con una abundancia de expresión extremadamente baja para la hibridación de saturación, lo que puede causar la pérdida de ADNc de algunos genes. Hace veinte años, las investigaciones basadas en la hibridación ADN-ARN habían clasificado los niveles de transcripción genética en tres categorías: alto, medio y bajo. Los estudios de seguimiento demostraron además que la mayoría de los genes tienen una abundancia de expresión media o baja, y contienen casi de 1 a 15 copias en una sola célula, mientras que las transcripciones de genes de alta abundancia pueden alcanzar alrededor de 5000 copias en una sola célula, lo que representa aproximadamente 10 % de la expresión total de 25. Esta enorme diferencia en la capacidad de expresión genética se convierte en un obstáculo para obtener una biblioteca de ADNc completa y representativa, y la enorme diferencia en el nivel de expresión añade dificultad a la investigación a gran escala. Para una biblioteca de ADNc de un solo tejido, la existencia de una gran cantidad de secuencias de genes con alto número de copias genera un desperdicio innecesario para la detección e identificación de genes, especialmente en la secuenciación EST a gran escala.

Las bibliotecas de ADNc homogeneizadas son una medida eficaz para superar los obstáculos que plantean las enormes diferencias en los niveles de transcripción genética para la detección y el análisis de bibliotecas, y son beneficiosas para la investigación sobre la expresión genética y el análisis de secuencias. En la actualidad, existen al menos dos puntos de vista principales sobre la construcción de bibliotecas de ADNc homólogas: una se basa en el principio de la cinética de renaturalización. El ADNc de alta abundancia se renaturaliza rápidamente en condiciones de hibridación, mientras que el ADNc de baja abundancia tarda mucho tiempo en renaturalizarse. por lo que puede controlar el tiempo de renaturalización para reducir la abundancia; el otro se basa en la relativa homogeneidad del ADN genómico en número de copias, y reduce la abundancia de ADNc con alto número de copias en la biblioteca mediante la hibridación de saturación de ADNc y ADN genómico.

Dominar el primer método requiere alta tecnología, y la mayoría de la gente necesita explorar muchas veces para encontrar las mejores condiciones. El último método es fácil de dominar, pero algunos investigadores han propuesto sus deficiencias basándose en el principio de la cinética de renaturalización, es decir, la saturación. Método de hibridación del ADN genómico, debido al pequeño número de copias de genes expresados ​​con pocas copias, no se producirá la hibridación. La mayoría de las bibliotecas de ADNc homólogas informadas hasta ahora se construyen basándose en el segundo principio. La estrategia comúnmente utilizada es la hibridación de ARNm-ADNc basada en tecnología de PCR combinada con renaturalización múltiple de ADNc. Se informa que después de analizar las secuencias diana altamente expresadas seleccionadas, el ADNc expresado altamente abundante de la biblioteca después de la homogeneización fue de 0,3 a 2,5 del anterior al tratamiento, cumpliendo básicamente los requisitos para una selección económica.

Las bibliotecas de ADNc homogéneas tienen las siguientes cuatro ventajas: en primer lugar, tienen una amplia gama de aplicaciones económicas y pueden ahorrar muchos costes experimentales. En segundo lugar, aumenta la oportunidad de clonar ARNm de baja abundancia, que es adecuado para el análisis de la expresión genética y la detección de mutaciones en diversas etapas de desarrollo o tejidos. En tercer lugar, la hibridación de sondas de ADNc correspondientes a la abundancia original de copias de ARNm con bibliotecas de ADNc homogeneizadas puede estimar los niveles de expresión de la mayoría de los genes y descubrir algunos genes específicos de tejido. Sin embargo, la construcción anterior de la biblioteca ignoró el efecto de la abundancia de ARNm. En cuarto lugar, puede utilizarse para producir mapas genéticos y realizar hibridación in situ a gran escala. Como sistema de biblioteca optimizado, también se puede utilizar para secuenciación a gran escala o producción de chips.

2.2 Biblioteca de ADNc sustraída

Biblioteca sustraída, también conocida como biblioteca sustraída, es el uso de dos materiales con el mismo o casi el mismo trasfondo genético pero diferentes funciones o propiedades (como líneas celulares tratadas con diferentes genes) o líneas de plantas casi isogénicas) para extraer ARNm (o sintetizar ADNc después de la transcripción inversa). En determinadas condiciones, se utiliza un gran exceso de uno de los genes no diana como impulsor para la hibridación con la sustancia de prueba que contiene el gen diana, y el complejo formado por la hibridación de las dos partes del mismo gen se elimina selectivamente. El proceso de eliminación de hibridación suele realizarse repetidamente. Finalmente, la fracción no hibridada que contiene los genes diana relevantes se recoge y se liga en un vector para formar una biblioteca. La hibridación sustractiva es el núcleo de la construcción de una biblioteca de ADNc sustractiva, y el éxito de la construcción de una biblioteca sustractiva depende en gran medida de la eficiencia de la hibridación sustractiva. Los principales métodos de hibridación sustractiva incluyen (1) cromatografía en columna de hidroxiapatita (HAP); (2) marcado con biotina y métodos de exclusión y unión de estreptavidina; (3) métodos sustractivos combinados con tecnología de endonucleasas de restricción (4) hibridación por supresión sustractiva (SSH); (5) MAST mediado por perlas magnéticas, de los cuales el método SSH es el más utilizado.

La hibridación sustractiva por supresión (SSH) es un nuevo método para aislar genes expresados ​​diferencialmente desarrollado por DIATCHENKO et al. en 1996. Se utiliza principalmente para separar dos tipos de células o dos tejidos. . Utiliza principalmente PCR de supresión para amplificar exponencialmente fragmentos expresados ​​diferencialmente con diferentes conectores en ambos extremos de los materiales diana con la misma abundancia después de la hibridación sustractiva, mientras que los fragmentos homólogos de doble cadena con los mismos conectores en ambos extremos solo se amplifican linealmente. de enriquecer genes expresados ​​diferencialmente. Por lo tanto, esta tecnología se puede utilizar para clonar genes diana de abundancia alta, media y baja de dos materiales (células o tejidos) expresados ​​diferencialmente de forma eficaz, rápida y sencilla. En los últimos años se ha utilizado con éxito en el análisis y clonación de genes de respuesta relacionados con el desarrollo de plantas, tumores y enfermedades, así como de tejidos y células inducidas por factores externos.

2.3 Construcción de una biblioteca de ADNc en fase sólida

La síntesis de ADNc en fase sólida es una tecnología bien conocida desde hace mucho tiempo, pero su limitación es que los oligo(dT) y la celulosa coloidal partículas o perlas magnéticas están fuertemente unidas, el rendimiento al eluir el ADNc no es muy alto y los pasos de reacción posteriores no se pueden realizar en el medio, lo que puede ser la razón por la cual esta tecnología no se usa ampliamente.

Recientemente, THOMAS ROEDE propuso un nuevo método para la síntesis en fase sólida de bibliotecas de ADNc (THOMAS ROEDE, 1998), que supera las deficiencias de la construcción de bibliotecas anteriores. Las enzimas y reactivos utilizados son exactamente los mismos que los del método tradicional, excepto que la síntesis y modificación del ADNc se completa en soportes sólidos: perlas magnéticas.

El ADNc se inmoviliza en perlas magnéticas acopladas a estreptomicina a través de biotina, de modo que las enzimas y los tampones se pueden reemplazar fácil y rápidamente durante la reacción, por lo que se combinará rápidamente con la construcción de bibliotecas de alta calidad (solo toma 1d), la biblioteca construida. Es adecuado para la mayoría de los propósitos de investigación.

La principal ventaja de la síntesis de ADNc en fase sólida es que puede simplificar el funcionamiento de la síntesis de ADNc. Al cambiar el tampón, no hay necesidad de preocuparse por la pérdida de ADNc o la contaminación de otras sustancias. Además, dado que se omiten los pasos de fraccionamiento y aislamiento antes de la clonación, con este método se pueden obtener bibliotecas verdaderamente representativas que contienen ADNc cortos. En resumen, el método en fase sólida combina las ventajas de la síntesis tradicional de ADNc y compensa sus deficiencias. Este método es simple, confiable, barato y tiene una alta calidad de biblioteca, y tiene el potencial de reemplazar los métodos de operación de biblioteca de ADNc utilizados actualmente.

Además, la construcción de microARN de ADNc recientemente desarrollada utiliza tecnología de PCR para amplificar la cantidad de ADNc de ARNm en condiciones de laboratorio. La sensibilidad de la detección por PCR es mucho mayor que la de RT-PCR. La construcción de una biblioteca de PCR de ADNc de ARN traza puede facilitar el estudio de genes traza de sustancias activas.

Método de aislamiento de nuevos genes utilizando 3 bibliotecas de ADNc

Descubrir, aislar y clonar nuevos genes siempre ha sido la principal tarea y propósito de la investigación en biología molecular. Aunque las bibliotecas de ADNc tienen muchos usos, su uso más importante es el aislamiento de nuevos genes. No importa qué biblioteca de ADNc mencionada anteriormente se pueda utilizar para aislar nuevos genes, pero los métodos utilizados son diferentes. Hay dos métodos de separación principales: primero, para bibliotecas de ADNc que no son de longitud completa, ya sea un método de biblioteca de ADNc clásico o una biblioteca de ADNc construida mediante el método de sustracción, es necesario utilizar los nuevos fragmentos de secuencia de ADNc obtenidos para obtener la secuencia completa. Secuencia de longitud del nuevo gen. En segundo lugar, la biblioteca de ADNc de longitud completa y los fragmentos del gen diana se utilizaron como sondas para la detección de hibridación.

3.1 Detección de nuevos genes a partir de bibliotecas de ADNc no completas

3.1.1 Métodos de competición

La biblioteca RACE es una amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE). Con solo conocer una secuencia corta en el ARNm se pueden amplificar los 5' (5'RACE) y 3' (3'RACE) de su ADNc. La principal característica de este método es el uso de cebadores específicos diseñados a partir de secuencias conocidas y cebadores universales complementarios al PolyA del ARNm (3'RACE) o de la cola homóloga (5'RACE) añadidos en el extremo 3' del primero. -cadena de ADNc. Debido a que los cebadores homólogos no son buenos cebadores de PCR y para facilitar la clonación de productos RACE, se puede agregar un sitio de endonucleasa al extremo 5' del cebador homólogo. El molde de ADNc utilizado puede sintetizarse por extensión utilizando cebadores polidT (3',5'-RACE es aceptable). Cuando el producto de RACE PCR es una mezcla compleja, parte del producto se puede usar como plantilla y otra secuencia ubicada dentro del cebador original se puede usar como cebador, emparejada con un cebador universal, para realizar otra ronda de PCR ( PCR anidada). Ya en 1988, FROHMAN et al. obtuvieron con éxito las secuencias de los extremos 5' y 3' de cuatro tipos de ARNm utilizando este método.

Hasta ahora, ha habido varios métodos RACE mejorados, que se diferencian del informe original de FROHMAN mediante modificaciones y optimización: (1) BARSON et al utilizaron nucleótidos de oligodesoxitimina bloqueados. El cebador "bloquea" el 3'. extremo de la secuencia específica del gen y su cola Poly (A), y sintetiza 1 hebra de ADNc. Elimina el efecto de unión de cualquier parte de la cola Poli (A) del molde de ARN oligo (dT) al sintetizar la primera cadena de ADNc. (2) Los equipos de EDWARDS y TROUTT utilizaron ARN ligasa T4 para conectar oligonucleótidos al extremo 5' del ADNc monocatenario, y luego utilizaron cebadores específicos del extremo 3' y cebadores de anclaje para amplificar y clonar directamente el ADNc anclado in vitro. Posteriormente, Bertling et al. utilizaron ADN ligasa en lugar de ARN ligasa. Estos métodos evitan la generación de ADNc truncado debido a la complementariedad de regiones de secuencia homóloga en la segunda cadena de ADNc.

(El método cRACE propuesto por Maruyama et al. utiliza cebadores específicos de genes, por lo que básicamente no produce productos de PCR no específicos. Empresas como Clontech también han lanzado kits correspondientes para RACE basados ​​en la actualización del método RACE, proporcionando una herramienta conveniente para la clonación de ADNc Recientemente, Huang et al. utilizaron el kit RACE para clonar receptores inmunes que contienen hemaglutinina vegetal

3.1.2 Clonación rápida de genes de bibliotecas de ADNc mediante PCR. Al examinar bibliotecas o aplicar métodos simples, el uso de múltiples cebadores para realizar reacciones de PCR a menudo solo da como resultado fragmentos de ADNc incompletos, lo que a menudo requiere una nueva evaluación de las bibliotecas. Aunque RACE es conveniente, se requiere una nueva extracción del ARNm. El método de PCR para clonar rápidamente genes de bibliotecas de ADNc solo requiere extraer ADN del fago λ y diseñar cebadores de PCR basados ​​en secuencias conservadas para clonar fragmentos desconocidos, especialmente cuando los dos extremos del gen son significativamente diferentes y se conserva una determinada región en el medio. Es fácil obtener ADNc de longitud completa mediante PCR. El mismo producto de transcripción tiene diferentes patrones de empalme. Es menos probable que se examinen clones con diferentes patrones de empalme simultáneamente mediante la detección de la biblioteca, pero es beneficioso observar diferentes patrones de empalme después de la amplificación por PCR. Además, para estudiar la expresión de genes en diferentes tejidos, a menudo se utilizan métodos de visualización diferencial para encontrar ARNm específicos.

3.2 Detección de hibridación a partir de bibliotecas de ADNc completas

3.2. 1 Sondas marcadoras. Método de detección de bibliotecas de ADNc con aguja

Las bibliotecas de ADNc generalmente se recubren en el medio de cultivo principal y luego las muestras de estas colonias se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nailon y se agregan sondas marcadas; , y si hay señal de hibridación, se pueden aislar y cultivar colonias que contienen señales de hibridación, y se pueden seleccionar y secuenciar clones positivos para obtener ADNc de longitud completa. Este método puede evitar la amplificación no específica o el emparejamiento incorrecto de la amplificación por PCR y es un método más preciso. Método de clonación de ADNc preciso y confiable La principal desventaja es que el proceso de clonación requiere una serie de reacciones enzimáticas, tiene un bajo rendimiento, requiere mucho tiempo y tiene una gran carga de trabajo. Este método es adecuado para la detección y el aislamiento del ADN utilizado. sondas marcadas el fragmento puede ser un fragmento de gen de otros organismos. En este caso, el gen seleccionado es a menudo un gen homólogo del gen aislado si el fragmento de ADN usado como sonda marcadora es un análisis inverso de aminoácidos proteicos recién aislados. Secuencia de ADN, o Es una secuencia de ADN de marcador molecular específico, luego se pueden descartar nuevos genes funcionales.

3.2.2 PCR inversa

El principio genético de la clonación trans-PCR completa. -El ADNc de longitud es: doble. Después de sintetizar el ADNc hebrado, se conecta de extremo a extremo y el ADNc circularizado se corta mediante un sitio de endonucleasa de restricción de una secuencia conocida o se desnaturaliza con NaOH, y luego el ADNc linealizado o desnaturalizado. se amplifica utilizando dos cebadores específicos de genes La ventaja de la trans-PCR es que utiliza dos cebadores específicos de genes y no es propenso a una amplificación no específica. Este método puede amplificar rápida y eficientemente fragmentos en ambos lados de secuencias conocidas en el ADNc. .

4 Resumen

Con el rápido desarrollo de la biología y la tecnología de la información, encontrar nuevos genes, clonar nuevos genes y luego estudiar las funciones de los genes se han convertido en tareas importantes en la investigación de la genómica funcional. En el pasado, la hibridación sustractiva, la visualización diferencial de ARNm, el análisis de visualización diferencial representativa de ADNc y la visualización sustractiva eran los métodos más utilizados para descubrir nuevos genes. Estos métodos tienen sus propias ventajas únicas en el descubrimiento de nuevos genes y pueden descubrir algunas secuencias expresadas diferencialmente, pero la mayoría de estas secuencias expresadas diferencialmente son genes incompletos. En la actualidad, el método más factible y ampliamente utilizado es principalmente el cribado de bibliotecas de ADNc. Por un lado, las bibliotecas de ADNc sólo representan genes que se están expresando en un período determinado y bajo ciertas condiciones, y son un pequeño número de secuencias en todo el genoma eucariota, por lo que la complejidad de la clonación de ADNc es mucho menor que la clonación directa de el genoma, por otro lado, dado que cada clon de ADNc representa sólo una secuencia de ARNm, la probabilidad de falsos positivos en el proceso de clonación de genes es relativamente baja, por lo que la construcción de bibliotecas de ADNc se ha convertido en la base de la investigación actual en biología molecular e ingeniería genética; operaciones.

El método de construcción de la biblioteca de ADNc involucrado en este artículo es un método de uso común actualmente. Cada uno de estos métodos tiene pros y contras. Los investigadores deben elegir tecnologías apropiadas en función de su situación real, que hayan logrado los objetivos deseados.