¿Cuál es la función del medio de cultivo?
Según las diferentes materias primas utilizadas, se pueden dividir en dos categorías: los preparados con ingredientes naturales como caldo y jugo de patata se denominan medios de cultivo naturales, los preparados con preparados químicos y etiquetados con los ingredientes; Se denomina base de cultivo sintética o medio integral. La mayoría de los medios de cultivo de los reactivos químicos son medios sintéticos. Dado que el medio de cultivo líquido no es fácil de almacenar durante mucho tiempo, ahora se presenta en forma de polvo. Debido a las diferentes materias primas utilizadas para preparar el medio de cultivo, los requisitos de uso son diferentes y el almacenamiento y la conservación también son ligeramente diferentes. Los medios de cultivo generales son propensos a la contaminación bacteriana o a la descomposición y deterioro después de absorber calor y humedad. Por lo tanto, los medios de cultivo generales deben protegerse de la humedad y la luz y almacenarse en un lugar fresco. Para algunos medios que requieren una esterilización estricta (como los medios de cultivo de tejidos), el tiempo de almacenamiento es prolongado y deben colocarse en un refrigerador entre 2 y 6 °C.
Los medios de cultivo más utilizados son:
1. Medio de cultivo bacteriano
Receta 1 Medio de cultivo agar extracto de ternera
Extracto de ternera 0,3 g , 1,0 g de peptona, 0,5 g de cloruro sódico, 1,5 g de agar,
100 ml de agua
En un vaso de precipitados que contenga 100 ml de agua, añadir extracto de carne, peptona y cloro Para disolver el sodio, marque el exterior del vaso con un crayón. Marca el exterior del vaso con un crayón y colócalo sobre el fuego para calentar. Cuando el contenido del vaso esté disuelto añadir el agar, removiendo constantemente para evitar que se pegue al fondo. Después de que el agar esté completamente disuelto, recupere el agua perdida, use ácido clorhídrico al 10 % o hidróxido de sodio al 10 % para ajustar el pH de 7,2 a 7,6, divídalo en varios tubos de ensayo, agregue tapones de algodón y esterilice con un autoclave durante 30 minutos.
Receta 2 Medio de cultivo de patata
Tomar 250 gramos de corazón de res fresco (quitar grasa y vasos sanguíneos), picar en trozos finos con un cuchillo, añadir 500 ml de agua destilada y 5 gramos de peptona. Marcar el vaso, llevar a ebullición y cocinar a fuego lento durante 2 horas. Colar, secar la carne y ajustar el pH del filtrado a aproximadamente 7,5. Añadir a cada tubo 10 ml de caldo y una pequeña cantidad de corazón de res seco picado, esterilizar y reservar.
Receta 3 Medio de cultivo de Rhizobium
Glucosa 10 g, hidrogenofosfato dipotásico 0,5 g
Carbonato de calcio 3 g, sulfato de magnesio 0,2 g
Levadura en polvo 0,4 g, agar 20 g
1000 ml agua, solución de cristal violeta al 1% 1 ml
Hervir el agar con agua para disolverlo, y luego añadir el resto de ingredientes por separado. Después de revolver para disolver, tomar alícuotas, esterilizar y reservar.
2. Medio de cultivo de actinomicetos
Receta 1 Medio agar almidón (medio Korich)
Almidón soluble 2g, nitrato potásico 0,1g
Hidrogenofosfato dipotásico 0,05g Cloruro sódico 0,05g
Sulfato de magnesio 0,05g Sulfato ferroso 0,001g
Agar 2g 100ml agua
Primero añade agua a ebullición y disuelve el almidón, luego agregue los demás ingredientes respectivamente, revuelva para disolver, haga alícuotas, esterilice y reserve.
Primero ponga el almidón en un vaso de precipitados, agregue 5 ml de agua para hacer una pasta, luego vierta 95 ml de agua, revuelva uniformemente y agregue otros medicamentos para disolver. Marque el exterior del vaso, agregue el agar cuando esté caliente a ebullición y revuelva continuamente hasta que el agar se disuelva por completo y recupere el agua perdida. Ajuste el valor del pH a 7,2-7,4 y esterilice en lotes para su uso posterior.
Receta 2: Medio Agar Harina
60 gramos de harina, 20 gramos de agar
1000 ml de agua
Añadir harina a agua para hacer una pasta, agregue agua a 500 ml y cocine por 30 minutos. Tomar otros 500 ml de agua, agregar agar, calentar y cocinar hasta disolver, mezclar los dos líquidos, agregar agua, ajustar el pH a 7,4, envasar, esterilizar y reservar.
3. Medio de cultivo de hongos
Preparación de medio de cultivo Sabauru
10 gramos de peptona, 20 gramos de agar
40 gramos de maltosa, agua 1000 ml
Primero calentar y remover peptona, agar y agua. Después de que el agar se disuelva, añadir 40 gramos de maltosa (o glucosa). Después de que se disuelva el agar, agregue 40 gramos de maltosa (o glucosa), revuelva para disolver, luego haga alícuotas, esterilice y reserve.
Este cultivo se utiliza habitualmente para el cultivo de una gran variedad de hongos.
Receta 2 Medio Agar Patata Azúcar
Lavar y pelar las patatas, cortar 200 gramos en trozos pequeños, añadir 1000 ml de agua, hervir durante media hora y reponer agua. Agregar 10 gramos de agar al filtrado, hervir y disolver, luego agregar 20 gramos de azúcar (agregar sacarosa para el cultivo de moho, glucosa para el cultivo de levadura), agregar suficiente agua, tomar alícuotas, esterilizar y reservar.
Ajuste el valor del pH del medio de cultivo a 7,2-7,4. Los azúcares como la glucosa en la fórmula también se pueden utilizar para cultivar actinomicetos y bacilos.
Receta 3 Medio de cultivo jugo de brotes de soja
100 g de brotes de soja 15 g de agar
20 g de glucosa 1000 ml de agua
Brotes de soja Lavar, agregar agua y hervir durante 30 minutos. Filtrar con una gasa, agregar agar al filtrado, calentar para disolver, agregar azúcar, revolver para disolver, agregar agua hasta 1000 ml, tomar alícuotas, esterilizar y reservar.
Ajustando el valor de pH de este medio entre 7,2-7,4, se puede utilizar para cultivar bacterias y actinomicetos.
Receta 4: Agar guisante medio
80 guisantes, 5g de agar
200 ml de agua
Coger 80 guisantes secos y agua, hervir durante 1 hora, filtrar con una gasa, agregar agar al filtrado, cocinar hasta disolver, dividir en alícuotas, esterilizar y reservar.
4. Medio de cultivo de hongos comestibles
Preparar medio de patata-sacarosa-agar
1000 ml de zumo de patata al 20%
20 gramos de sacarosa y 18 gramos de agar
Lavar y pelar las patatas y cortarlas en trozos pequeños. Pesar 200 gramos de patatas en dados, añadir 1000 ml de agua, hervir durante 20 minutos y filtrar. Agregue agua al jugo colado hasta completar 1000 ml, o el 20% del jugo de papa. Agregue agar y sacarosa al jugo de papa, hierva para disolver, agregue suficiente agua, haga alícuotas, esterilice y reserve. El uso de este medio no tiene requisitos estrictos de pH y no se puede medir.
Receta 2 Medio de cultivo integral de patata
Zumo de patata 20% 1000 ml
3 gramos de dihidrogenofosfato de potasio, 1,5 gramos de sulfato de magnesio
20 gramos de glucosa, 10 mg de vitaminas
18 gramos de agar
La preparación del jugo de patata al 20% es la misma que la anterior. Agregue los ingredientes anteriores al jugo de cocción, caliente para disolver, agregue humedad y ajuste el pH a 6. Empacar, esterilizar y reservar. Este medio de cultivo se utiliza para el cultivo y conservación de cepas de hongos comestibles como Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus y hongos Shiitake.
5. Medio de cultivo de tabaco
En el cultivo de tejidos vegetales, la diferenciación del callo en raíces o brotes puede verse afectada ajustando la proporción de IAA y CTK. Cuando CTK/IAA es alto, el callo se diferencia en brotes
Cuando CTK/IAA es bajo, el callo se diferencia en raíces;
Preparación de medio de inducción de callo
Sobre la base de la solución madre de medio de cultivo MS, agregue 100 ml de solución madre de nutrientes macromoleculares 20×, 20 ml de solución madre de oligoelementos 100×, 20 ml de solución madre de sal de hierro 100×, 20 ml de solución madre de vitamina 100×, 10 ml de solución madre de inositol 200×, y 10 ml de licor madre de glicina 200× en un recipiente de aluminio limpio, agregue 0,5 mg/l-1,5 mg/l-1,5 mg de vitaminas, 10 ml de licor madre de inositol 20× y 10 ml de licor madre de glicina 200×. Agregar 0,5mg-L-1 de BA8mL y 0,5mg-L-1 de NAA8mL.
Luego agregue agua destilada con un volumen real de aproximadamente 2/3-3/4 del medio de cultivo preparado, agregue 40 g de sacarosa y revuelva para disolver, y ajuste el pH a 5,8-6,0 con NaOH 0,5 mol-L-1 y 0,5 mol-L-1 HCl. Añadimos 14g de agar, colocamos la bandeja de aluminio sobre la placa caliente y añadimos el agar. Agrega 14g de agar, coloca la olla de aluminio en la estufa eléctrica y calienta mientras revuelves para disolver completamente el agar, luego usa agua destilada para llevar el volumen final a 2L, continúa calentando por unos minutos para uniformar la mezcla y luego distribuye. en matraces Erlenmeyer.
Inducción de callos de hojas de tabaco
Tome una placa de Petri esterilizada, use un bisturí para cortar 1-2 hojas de plántulas estériles en la placa de Petri esterilizada y córtelas con un bisturí. las hojas en trozos pequeños de unos 2 mm2 y luego inocularlas en el medio de cultivo preparado. Inocular 5 trozos en cada botella e inocular 6 botellas en una sola bola. Los triángulos inoculados se cultivaron a 24°C en oscuridad durante 1 semana y luego a la misma temperatura en luz y oscuridad total durante 3 semanas hasta la formación de callo (3 frascos en cada caso).
Observa los resultados y calcula la tasa de inducción de callos.
Cultivo de diferenciación de órganos y regeneración de plantas
Transfiera el tejido de callo inducido al medio de diferenciación según el tipo de tejido de callo e ilumínelo continuamente a 20-22 C. Después de cultivar durante 3 semanas se contó la regeneración del callo.
Situación general de la inducción de callo
Después de 4 semanas de inducción y cultivo de callo de tabaco, el callo estaba básicamente formado, es decir, el callo que no se formó debido a un tiempo de crecimiento insuficiente fue Situación excluida
. Como se muestra en la Tabla I, seis botellas de cultivo tuvieron formación de callos en ausencia de contaminación, pero las tasas de inducción fueron casi diferentes
. La tasa media de callos de las tres botellas cultivadas en condiciones de luz fue del 60,0 ℅, y la tasa media de callos de las tres botellas cultivadas en condiciones de oscuridad fue del 46,7 %.
Debido al pequeño tamaño de los explantes, la mayoría de las células del explanto pueden haberse deshidratado y muerto durante el proceso de inoculación. La tasa de inducción de callos durante todo el experimento fue baja y la calidad del callo fue pequeña.
El medio también es medio 1640
Medio especial:
Un medio selectivo
1 Base de cultivo de enriquecimiento de levadura
Glucosa 5%, urea 0,1%, sulfuro de amonio 0,1%, dihidrógenofosfato de potasio 0,25%, hidrogenofosfato disódico 0,05%, sulfato de magnesio heptahidratado 0,1%, sulfato de hierro heptahidratado 0,01%, pasta de levadura 0,05%, ácido sulfúrico heptahidratado Hierro 0,05% , sulfato de hierro heptahidrato 0,01%, extracto de levadura 0,05%
Rojo de bengala 0,003% pH 4,5
2 El medio libre de nitrógeno de Ashby es rico en bacterias autótrofas fijadoras de nitrógeno
Glicitol 1%, dihidrógenofosfato de potasio 0,02%, sulfato de magnesio heptahidrato 0,02%, cloruro de sodio 0. sulfato de calcio dihidrato 0,01%, carbonato de calcio 0,5%
El segundo medio de identificación
Medio de cultivo EMB, comúnmente utilizado para identificar E. coli
Peptona 10 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, hidrogenofosfato dipotásico 2 g, eosina Y 0,4 g, azul de metileno 0,065 g
Agua destilada 1000g pH7.2
Receta de medio de aislamiento de microorganismos marinos
Receta de medio 2216E (medio sólido)
Peptona 5g
1g de extracto de levadura
0,01g fosfato férrico
15-----20g agar
1000ml agua de mar vieja
Solución de hidróxido sódico hirviendo (5 %) para ajustar el valor de pH a 7,6-7,8
Otros medios de cultivo:
1. Medio de cultivo n.º 1 de Gao:
KNO3: 1 g,
NaCl:0,5g,
K2HPO4:0,5g
MgSO4-7H2O:0,5g
FeSO4-7H2O:0,01g
Almidón soluble 20g
Agar 20g
Agua destilada 1000ml
Ajustar el pH a 7,2~7,4, esterilizar a 121°C durante 30 minutos
Método de preparación: Primero agregue una pequeña cantidad de agua al almidón para hacer una pasta, luego tome 700 ml de agua, caliéntelo en una estufa eléctrica y déjelo hervir
Luego, vierte la pasta de almidón mientras revuelves y mantenla hirviendo. hervido. A continuación añadir el resto de ingredientes,
Disolver y añadir agua hasta 1000 ml
Caldo peptona inclinado:
Peptona 10 gramos
Extracto de ternera 5 Gramos
Agua destilada 1000 ml
Cloruro de sodio: 5 gramos
pH: 7,0~7,2, esterilizado a 121°C durante 20 minutos
Calentar el agua a 700 ml y llevar a ebullición
Luego verter la pasta de almidón sin dejar de remover y seguir hirviendo. 20min
Si se prepara un medio de cultivo sólido, se debe agregar entre un 1,5% y un 2% de agar, y al medio de cultivo semisólido se puede agregar entre un 0,5% y un 0,8% de agar. 8%
Diferentes medios de cultivo celular
Medios de cultivo celular naturales
El medio de cultivo natural se refiere a uno extraído de fluidos corporales animales o extraído mediante separación de tejidos Medios de cultivo, tales como plasma, suero, linfa, embriones de pollo y otros medios de cultivo naturales se refieren a un medio de cultivo extraído de fluidos corporales animales o extraído mediante separación de tejidos, como plasma, suero, linfa, extracto de embrión de pollo, etc. En los primeros días de la tecnología de cultivo de tejidos, se utilizaban medios naturales para cultivar células in vitro. Sin embargo, debido al complejo proceso de producción de los medios de cultivo naturales y a las grandes diferencias entre lotes, poco a poco están siendo sustituidos por medios de cultivo sintéticos. Hoy en día, el medio natural más utilizado es el suero, mientras que para cultivar determinadas células específicas también son necesarios diversos extractos de tejido y sustancias similares al colágeno que favorecen la unión celular.
Tipos de suero
En la actualidad, el suero bovino es el principal suero utilizado para el cultivo de tejidos, pero también se utiliza suero humano y suero de caballo para el cultivo de determinadas células específicas.
Las razones para elegir suero bovino para cultivo celular son: fuentes suficientes, tecnología de preparación madura y una comprensión más profunda del suero después de un uso prolongado. El suero bovino es adecuado para la mayoría de las células de mamíferos, pero esto no excluye el uso de otros sueros animales cuando se cultivan determinadas células.
El suero bovino es el medio natural más utilizado en el cultivo celular y es rico en nutrientes necesarios para el crecimiento celular. El suero bovino se divide en suero de ternera, suero de ternera nuevo y suero de ternera fetal. El suero de ternera fetal debe obtenerse de terneros fetales nacidos por cesárea; el suero de ternera neonatal debe obtenerse de terneros recién nacidos dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento; el suero de ternera fetal debe obtenerse de terneros entre 10 y 30 días después del nacimiento. Obviamente, el suero fetal bovino es de la más alta calidad porque los fetos bovinos no han estado expuestos al mundo exterior y contienen la menor cantidad de anticuerpos, complementos y otros componentes dañinos para las células.
Principales componentes del suero
El suero es una mezcla compleja que se forma eliminando la fibrina del plasma. Aunque se conocen la mayoría de sus componentes, algunos no, así como su composición y contenido. El suero suele variar según el sexo, la edad, las condiciones fisiológicas y el estado nutricional de los animales donantes de sangre. El suero contiene una variedad de proteínas plasmáticas, péptidos, grasas, carbohidratos, factores de crecimiento, hormonas, sustancias inorgánicas, etc. Estas sustancias están fisiológicamente equilibradas y pueden promover el crecimiento celular o inhibir las actividades de crecimiento.
Las principales funciones del suero
1. Aportar los nutrientes básicos necesarios para el crecimiento celular: aminoácidos, vitaminas, sustancias inorgánicas, lípidos, derivados de ácidos nucleicos, etc.
2. Aportan hormonas y diversos factores de crecimiento: insulina, hormona adrenocorticotrópica (hidrocortisona, dexametasona), hormonas esteroides (estradiol, testosterona, progesterona), etc. Factores de crecimiento, como el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento de plaquetas, etc.
3. Aportar proteínas de unión: La función de las proteínas de unión es transportar sustancias importantes de bajo peso molecular, como la albúmina que transporta vitaminas, grasas y hormonas, y la transferrina que transporta hierro. Las proteínas de unión desempeñan funciones importantes en el metabolismo celular.
4. Proporcionar factores promotores de contacto y factores de estiramiento para proteger las paredes celulares del daño mecánico.
5. Proporciona cierta protección a las células en cultivo: Algunas células, como las células endoteliales y las células de la médula ósea, liberan proteasas y los componentes antiproteasas del suero pueden neutralizar estas proteasas. Este efecto se descubrió accidentalmente y ahora el suero se utiliza específicamente para detener la digestión de la tripsina. La tripsina se usa ampliamente para digerir las células parietales. Las proteínas séricas forman la viscosidad del suero, que protege a las células del daño mecánico y desempeña un papel importante, especialmente al agitar cultivos en suspensión. El suero también contiene oligoelementos e iones como SeO3 y Selenio que desempeñan un papel importante en los procesos de desintoxicación metabólica.
Principales problemas con los medios de cultivo de suero
1. Puede haber cientos de componentes en el suero. Los componentes exactos, el contenido y el mecanismo de acción del suero aún no están claros, especialmente algunos péptidos. Los factores de crecimiento, las hormonas y los lípidos aún no se conocen completamente, lo que plantea muchas dificultades a los trabajos de investigación.
2. El suero se produce en lotes. Los diferentes lotes de suero son muy diferentes y el tiempo de almacenamiento es de hasta un año, por lo que es extremadamente difícil garantizar la similitud de cada lote de suero. limitando la precisión del experimento. Estandarización y continuidad.
3. Para la mayoría de las células, el suero no es el líquido fisiológico con el que entran en contacto en el cuerpo. Sólo entran en contacto con el suero cuando el daño se cura y la sangre se coagula. suero Al alterar el estado normal de células específicas del cuerpo, el suero puede promover el crecimiento de ciertos tipos de células (fibroblastos) e inhibir el crecimiento de otros (células epidérmicas).
4. El suero contiene sustancias tóxicas para las células, como la poliaminooxidasa, que reacciona con poliaminas (como la espermina y la espermidina) en células muy multiplicadas para formar células con poliespermina tóxica. El complemento, los anticuerpos y las toxinas bacterianas pueden afectar el crecimiento celular e incluso provocar la muerte celular.
5. La calidad del suero varía mucho de diferentes lotes y la composición del suero no puede ser consistente.
6. Se pueden introducir micoplasmas y virus en la muestra, lo que puede tener un impacto potencial en las células y provocar fallos experimentales o resultados experimentales poco fiables.
7. El suero es cada vez más difícil de obtener y caro de producir a gran escala, convirtiéndose en una parte importante de los costes de producción de cultivos de células animales.
Estándares de Calidad del Suero
La calidad del suero depende de dos factores: el animal de muestreo y el proceso de muestreo. Los animales utilizados para el muestreo deben estar sanos, libres de enfermedades y dentro del número de días especificado desde el nacimiento. El proceso de muestreo debe realizarse estrictamente de acuerdo con los procedimientos y el suero preparado debe someterse a un estricto control de calidad. El "Reglamento sobre la Producción de Productos Biológicos Utilizando Cultivos In Vitro de Células Animales" publicado por la Organización Mundial de la Salud exige:
1. El suero bovino debe obtenerse de rebaños bovinos o de países sin registros de encefalopatía espongiforme bovina ( EEB) y debería contarse con un sistema de seguimiento. Se debe establecer un sistema de seguimiento adecuado.
2.
2. Algunos países también exigen que el suero bovino debe provenir de ganado que no se alimenta con proteínas de rumiantes.
3. Acreditar que el suero bovino utilizado no contiene inhibidores del virus vacunal.
4. Esterilizar el suero mediante filtración por membrana para garantizar la esterilidad.
5. No contiene bacterias, moho, micoplasmas ni virus, y en algunos países no contiene fagos.
6. Tiene un buen efecto de apoyo a la reproducción celular.
Mi país ha propuesto normas más estrictas para la calidad del suero bovino en la edición de 2000 de las "Normas de control de calidad de China para las principales materias primas y excipientes de productos biológicos". Incluyendo contenido de proteínas, bacterias, hongos, micoplasmas, virus bovinos, fagos coli, endotoxinas bacterianas, apoyo a la proliferación celular, etc.