¿Cuáles son los pasos para la secuenciación de genes?
Reactivo de detección
Plantilla de ADN bicatenario amplificado por PCR
Cerbador de ADN de unos 20 nucleótidos de longitud
Enzima de polimerización de ADN
Gel de secuenciación
0,1 mol/L DDT
α-32P-dATP
Mezcla dNTP/ddNTP (80 μmol /L/8 μmol/ L)
dNTP (0,75 μmol/L cada uno de dCTP, dGTP y dTTP)
Tampón de reacción de secuenciación: 40 mmol/L Tris-HCl (pH 7,5), 20 mmol/L L MgCl2, 50 mmol/L NaCl
Tampón de parada: 95 formamida, 50 mmol/L NaCl
Tampón de parada: 95 formamida, 50 mmol/L NaCl
Tampón de parada: formamida 95, NaCl 50 mmol/L
Tampón de secuencia: formamida 95, EDTA 20 mmol/L, azul de bromofenol 0,05, cianuro de xileno 0,05
Pasos de detección:
1. Agregue 2,5 µl de la mezcla de dNTP/ddNTP a cada uno de los 4 tubos de microcentrífuga, caliente a 37 °C durante 5 minutos y reserve.
2. Agregue 2,5 μl de la mezcla dNTP/ddNTP a cada uno de los 4 tubos de microcentrífuga, caliente a 37 °C durante 5 minutos y reserve.
2. Añadir 1 pmol de ADN bicatenario amplificado por PCR, 10 pmol de cebador de secuenciación, 2 µl de tampón de secuenciación 5X y agua bidestilada a un tubo de microcentrífuga vacío hasta un volumen total de 10. µl, 96 OC Calentar durante 8 minutos, enfriar en un baño de hielo durante 1 minuto y centrifugar a 10.000 g durante 10 segundos a 4 OC.
3. Agregue 2 μl de solución de etiquetado preenfriada, 2 μl de mezcla de etiquetado preenfriada (0,75 μmol/L de cada uno de dCTP, dGTP, dTTP), 5 μCi de α-32P-dATP, 1 μl de 0,1 mol/L de DDT. , 2U de enzima de secuenciación y 15 μl de agua, mezclar bien y colocar en hielo durante 2 minutos para etiquetar la cadena de ADN recién sintetizada.
4. Agregue 3,5 μl de la mezcla de reacción de etiquetado a cada uno de los cuatro tubos de ensayo en el paso 1, incube a 37 °C durante 5 minutos y agregue 4 μl de solución de parada a cada tubo.
5. Calentar y desnaturalizar la muestra en un baño de agua a 80°C durante 5 minutos, añadir 2 μl a cada carril del gel de secuenciación y realizar electroforesis para separar los fragmentos.
Notas:
1. El producto de PCR debe tener una cierta longitud (200 pb), porque la precisión del patrón de pico de electroforesis de 20-30 pb en ambos extremos de los resultados de la secuenciación es bajo.
2. Para la purificación de los productos de la PCR, se puede utilizar la cromatografía de intercambio iónico para separar los fragmentos de ADN amplificados de los dNTP restantes y también se pueden utilizar los cebadores de la reacción; la electroforesis en gel de agarosa para separar los productos de la PCR; fragmentos de ADN amplificados no específicos. Separe el producto de amplificación del cebador si la especificidad de amplificación es alta, se puede purificar directamente mediante extracción con fenol: cloroformo y precipitación con etanol.
3. El principio del diseño de cebadores de secuenciación es similar al del diseño de cebadores de PCR. Se pueden sintetizar alrededor de 20 nucleótidos como cebadores en un sintetizador de ADN. Después de la purificación mediante cromatografía líquida de alta presión o electroforesis en gel de poliacrilamida. Se pueden utilizar como cebadores de secuenciación.
Método de secuenciación por ciclos de PCR
El método de secuenciación por ciclos de PCR es un método de investigación que combina la tecnología de amplificación por PCR con la tecnología de análisis de secuencias de ácidos nucleicos para determinar secuencias de nucleótidos. También se denomina método de secuenciación por amplificación lineal. . Este método utiliza un instrumento de PCR para calentar la plantilla de ADN y desnaturalizarla. Bajo la acción de la TaqDNA polimerasa, la plantilla se somete a múltiples rondas de reacciones de secuenciación de didesoxinucleótidos en un modo de ciclo de temperatura para amplificar linealmente las moléculas de ADN marcadas.
En comparación con los métodos de secuenciación anteriores, la ventaja de la secuenciación por ciclos de PCR es que reduce en gran medida el número de plantillas necesarias, puede aumentar la señal generada por la reacción de secuenciación y reducir la complejidad de la operación y la cantidad; de polimerasa; las reacciones de detección se pueden realizar en una pequeña cantidad de plantilla preparada; las reacciones de secuenciación realizadas a altas temperaturas permiten que la polimerización catalizada por ADN polimerasa pase a través de la región de la estructura secundaria de la plantilla. El ADN de bucle cerrado bicatenario se puede utilizar directamente como un. plantilla de reacción sin desnaturalización previa de bases. Debido a que la secuenciación del ciclo de PCR puede detectar secuencias específicas de manera simple y rápida, ha recibido una atención generalizada en la investigación del análisis de secuencias de ácidos nucleicos.
Reactivo de detección:
Kit de secuenciación de ADN
dNTP
ddNTP
Acrilamida
Bisacrilamida
Urea
TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina)
Persulfato de amonio
Gel secuenciador 6 : 6 acrilamida, 7 mmol/L de urea, 1×TBE.
Tampón de secuenciación 10×: Tris-HCl 100 mmol/L (pH 8,8), KCl 500 mmol/L, MgCl2 40 mmol/L, gelatina 0,01. 20 μmol/L dATP, 50 μmol/L dCTP, 50 μmol/L dGTP, 50 μmol/L dTTP
Mezcla de terminación: ddATP (600 μmol/L), ddCTP (600 μmol/L), ddGTP (100 μmol/L), ddTTP (1000 μmol/L)
Tampón de parada: formamida 95, EDTA 20 mmol/L, azul de bromofenol 0,05, xilonitrilo 0,05
Pasos de prueba
1. Agregue 3 µl de mezcla de parada a cada uno de los 4 tubos de centrífuga pequeños y colóquelos en hielo.
2. Agregue cebadores (4 pmol), 4 μl de tampón de secuenciación 10X, 10 μl de α-32P-dATP y 2U de TaqDNA polimerasa a la plantilla de ADN, luego agregue agua bidestilada a 30 μl. a fondo y agregue 7 μl a cada uno de los cuatro tubos de ensayo anteriores.
3. Añadir 30μl de aceite de parafina a la solución de reacción.
4. 95OC 30S, 50OC 30S, 72OC 60S****30 ciclos, las condiciones de ciclo apropiadas y el número de ciclos se pueden ajustar según la situación específica.
5. Una vez completada la reacción, agregue 5 μl de tampón de parada debajo de la capa de aceite y mezcle uniformemente con una pistola de muestreo.
6. Antes del muestreo, calentar y desnaturalizar las muestras en un baño de agua >80°C durante 5 minutos. Añadir 2 μl de cada muestra al gel de secuenciación para la separación de fragmentos por electroforesis.
Nota:
1. Prepare la plantilla de secuenciación: el producto de la PCR se puede purificar y recuperar mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión y usarse para análisis de secuencia. También se puede purificar y eliminar; mediante cromatografía en columna los dNTP y cebadores restantes después de la reacción de PCR se usan para el análisis de secuencia, el producto de PCR también se puede usar directamente para la secuenciación sin purificación, pero los resultados de esta secuenciación son deficientes; El producto de PCR también se puede utilizar directamente para la secuenciación sin purificación, pero los resultados de la secuenciación son deficientes. Se recomienda purificar el producto de PCR antes de la secuenciación. Los plásmidos purificados mediante diversos métodos estándar de preparación de plásmidos se pueden utilizar como plantillas de secuenciación. El fago M13, el mucílago y el ADN λ preparados mediante métodos estándar son todos adecuados para su uso como plantillas de secuenciación.
Sin embargo, cabe señalar que no debe haber secuencias de genes no objetivo complementarias a los cebadores en el sistema de reacción; de lo contrario, el experimento de secuenciación fallará.
2. Cebadores de secuenciación: Los cebadores de secuenciación son secuencias de oligonucleótidos sintetizadas para complementar específicamente la hebra plantilla de secuenciación. El extremo 5' del cebador se puede marcar con α-32P-dATP y polinucleótido quinasa T4. La proporción de cebadores, quinasas y α-32P-dATP en el sistema de reacción debe mantenerse óptima para obtener cebadores marcados con alta actividad específica; Las nuevas cadenas de ADN sintético también se pueden marcar con α-32P-dATP. La concentración del cebador no debe ser demasiado alta, de lo contrario es fácil formar dímeros de cebador o producir cebadores de amplificación no específicos.
3. Enzimas: Se pueden usar varias ADN polimerasas termoestables que carecen de actividad exonucleasa en el extremo 3'-5' para la secuenciación del ciclo, entre las cuales la ADN polimerasa Taq es la más comúnmente utilizada en la secuenciación de ADN. Aunque la aplicación del método de secuenciación por ciclos de PCR para la secuenciación de genes es simple y rápida, aún no puede satisfacer las necesidades de la secuenciación de ADN a gran escala. La combinación del método de secuenciación por ciclos de PCR, el método de etiquetado fluorescente y el secuenciador automático se ha convertido en la principal tecnología para las grandes empresas. -Secuenciación del genoma a escala. Esta tecnología utiliza cebadores marcados con fluorescencia o trifosfatos de didesoxinucleósidos. Después de que el producto de la reacción se procesa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, la secuencia de ADN que se va a analizar se procesa mediante un analizador y un sistema de análisis de secuencia de ADN específicos. Su aplicación reduce la carga de trabajo de la secuenciación de ADN y mejora la eficiencia de la secuenciación.