Cómo extraer papaína
1. Referencia------Wan Jing, Zhang Haide, Han Lin "Estudio sobre el proceso de extracción de papaína de Hainan Papaya con etanol"
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales principales
Papaya: Danzhou, Hainan; Reactivos utilizados: calidad analítica nacional.
1.2 Instrumentos principales
Espectrofotómetro UV: UV-2450, Shim adzu; temperatura constante
Baño de agua: tipo B-260, Shanghai Yarong Biochemical Instruments Factory; Medidor de pH de precisión: Modelo 320-S, Mettler toledo; Centrífuga refrigerada:
Hettich 32R, Zentrifugen; Balanza analítica: PB3002-N
Tipo, Mettlertoledo; .
1.3 Método experimental
1.3.1 Determinación de la actividad de la papaína Definición de unidad de actividad enzimática: En
condiciones especificadas, la enzima hidroliza la caseína y la libera en 1 min La absorbancia equivalente a
μg/m L de tirosina a una longitud de onda de 275 nm es 1 unidad de actividad. Utilice una solución de ácido clorhídrico de 0,1 mol/L como blanco y mida la absorbancia de la solución en blanco, la solución a medir y la solución de referencia a una longitud de onda de 275 nm [4].
1.3.2 Cálculo de la actividad enzimática [4]
Calcular la actividad enzimática según la siguiente fórmula:
Unidad de actividad de papaína por 1 mg =A /A s× Cs×
12/2×factor de dilución/W
En la fórmula: A es la absorbancia del líquido a medir menos la absorbancia de la solución blanco
;
p>
A s es la absorbancia de la solución de referencia;
Cs es la concentración de la solución de referencia de tirosina, μg/
m L;
W es la masa de la muestra, mg.
Una unidad de actividad de papaína equivale a liberar 1 μg de
tirosina. La concentración de enzima especificada es que 1 ml de solución de ensayo libera 40 μg de tirosina.
1.4 Método de operación
1.4.1 El experimento de extracción con etanol de papaína en papaya se llevó a cabo utilizando papaya verde fresca producida en Hainan. La papaína en papaya se extrajo en diferentes condiciones experimentales. , y después de una serie de experimentos, se determinaron los parámetros óptimos del proceso y finalmente se obtuvo una enzima papaína cruda con alta actividad enzimática.
El proceso de extracción es: papaya verde fresca → pelar y picar → agregar 30% de agua helada y triturar → filtrar → tomar el filtrado y centrifugar durante 15 min (3500 r/min, 4 ℃) → tomar el sobrenadante y desechar Precipitado → agregar agente protector de la actividad enzimática → agregar una cierta concentración de etanol () → ajustar el pH → dejar reposar durante la noche → centrifugar durante 20 min (5500 r/min) para recolectar el precipitado → medir la actividad enzimática → congelar al vacío secar → triturar → obtener enzima cruda.
1.4.2 Determinación de la actividad de la papaína [5] Se puede ver en 1.3.2 que el valor de absorbancia medido por el método ultravioleta es directamente proporcional a la actividad de la papaína. Este experimento utilizará el valor de absorbancia para. reflejan la actividad enzimática.
1.4.3 El experimento para determinar el agente protector de la actividad enzimática óptima utilizó L-cys y ED TA como agentes protectores de la enzima. Pesar con precisión L-cys 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,10 mol/L y ED TA 0,002, 0,004, 0,006, 0,008, 0,01 mol/L y agregarlos al filtrado centrifugado respectivamente, agregar etanol al 55% y ajustar después del pH. alcanza 8,8, se deja reposar durante la noche, se centrifuga para recoger el precipitado y se mide el valor de absorbancia con un espectrofotómetro UV.
1.4.4 Determinación del pH óptimo El experimento fue diseñado para investigar el valor del pH de 5,0 a 9,0. Agregue etanol al 55% al filtrado centrífugo sin agregar ningún agente protector enzimático y ajuste el pH a 5,0. 6,0, 7,0, 8,8, 9,0, 9,5, luego se deja reposar durante la noche, se centrifuga para recoger el precipitado y se mide el valor de absorbancia con un espectrofotómetro UV.
1.4.5 El experimento para determinar la concentración óptima de etanol se diseñó para investigar la cantidad de adición de etanol en el rango de 45 a 95. Se agregaron 45, 55 y 65 al filtrado centrífugo sin ningún protector enzimático. agente, etanol 75, 85 y 95, ajustar el pH a 8,8, dejar reposar durante la noche, centrifugar para recoger el precipitado y medir el valor de absorbancia con un espectrofotómetro UV.
1.4.6 La determinación del tiempo óptimo de reacción enzimática se investigó durante la determinación de la actividad enzimática. Cuando la temperatura de reacción era de 40 °C, los tiempos de reacción fueron 0, 5, 10, 15, 20 y 25. efecto mínimo sobre la actividad enzimática.
1.4.7 Determinación de la temperatura óptima de reacción enzimática Durante el proceso de medición de la actividad enzimática, las temperaturas de reacción enzimática fueron 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 °C. para cada reacción fue de 10 min.
1.4.8 Efecto de los iones metálicos sobre la actividad enzimática El experimento examinó el efecto de diferentes iones metálicos a la misma concentración (0,01 mol/L) sobre la actividad enzimática.
1.4.9 El efecto de diferentes concentraciones de Ca2 sobre la actividad enzimática se centra en los efectos de concentraciones de 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,10, 0,15, 0,20 mol/L y ninguna adición sobre la actividad enzimática.
Conclusión
En el proceso de extracción, las cantidades añadidas de L-cys y ED TA son 0,04 mol/L y 0,004 mol/L respectivamente, que tienen el mejor efecto sobre la actividad de la papaína. Para protección, el mejor efecto de extracción se puede obtener cuando la cantidad de adición de etanol es 45 y el pH es 7,0. En el proceso de determinación, el tiempo óptimo de reacción enzimática es de 10 minutos y la temperatura óptima de reacción enzimática es de 80 °C, lo que puede obtener una mayor actividad de la papaína. Al mismo tiempo, mediante la investigación de la influencia de los iones metálicos en la actividad enzimática. Cu2 y K tienen La actividad tiene un cierto efecto inhibidor, mientras que Ca2 tiene un cierto efecto activador sobre su actividad, y el mejor efecto es cuando la concentración es de 0,05 mol/L.
2. Referencia----"Proceso de extracción ultrasónica de papaína y sus propiedades enzimáticas" de Xiao Guiping
1. de solución enzimática: seleccione papaya fresca, lave, pele, semillas y pulpa, córtela en trozos, pese la pulpa y agregue una cierta cantidad de 4 ℃ de agua destilada para despulpar la pulpa debe procesarse; bajo ciertas condiciones, el tratamiento ultrasónico se llevó a cabo a 4000 r·min-1 durante 15 min después de la eliminación de impurezas y la filtración, el sobrenadante se ultrafiltró y se concentró utilizando una membrana de fibra hueca de PP con un límite de peso molecular de 20000 u, y el líquido enzimático; Las muestras se recolectaron en un refrigerador para su uso posterior. Para mantener la actividad de las muestras, enfríelas previamente a 0 - 4 ℃ antes del tratamiento ultrasónico. Tratamiento ultrasónico. La temperatura del líquido material debe controlarse lo más bajo posible durante todo el proceso.
Estado repetir 3 veces.
1. y la actividad de papaína. El contenido de proteína se determinó mediante el método de folin-fenol [7], y la curva estándar fue La ecuación de regresión
es:
y = 1570. 089x - 65. 181 (r = 0, 964, n = 9) (1)
Fórmula en: y representa la concentración de masa de proteína/(μg·mL - 1); x representa D (500 nm). /p>
Determinación de la actividad de la papaína: 1 mL de solución enzimática en determinadas condiciones de temperatura y pH, 1 min hidroliza la caseína para producir 1 μg de tirosina
1 unidad de actividad enzimática (U). hidroliza el sustrato de caseína, luego agrega ácido tricloroacético para terminar la reacción enzimática, y la caseína no hidrolizada se elimina. El precipitado se mide mediante espectrofotometría UV. La actividad enzimática se puede calcular en función de la densidad óptica. La solución estándar se puede encontrar en la literatura [9], y la curva estándar se devuelve a
La ecuación es:
y = 127.305x - 2.010 (r = 0 996, n = 5) (2)
Donde: y representa la concentración másica de tirosina / (μg·mL - 2) Precalentar a ℃ durante 2 minutos, agregar 2,00 ml; solución de caseína (10 mg·mL - 1 ), agitar bien al momento de agregar, y después de reaccionar por 10 minutos, agregar 4.00 mL de ácido tricloroacético, agitar bien inmediatamente y terminar la reacción, retirar del baño maría; dejar reposar durante 10 minutos y luego filtrar. A una longitud de onda de 275 nm, utilizar una cubeta de 10 mm para medir la D (275 nm) del filtrado. Hacer 3 muestras paralelas de la muestra de enzima para la prueba de control en blanco, agregar; primero ácido tricloroacético y luego agregar
solución de caseína. Repetir 3 veces.
Cálculo de la actividad enzimática:
X =A ×K ×8 /2 ×. 1/10 ×n ×E = 2/5 ×A ×K ×n ×E (3)
En la fórmula: X representa la actividad enzimática de la muestra/U; A representa la D (275 nm) de la solución de muestra; K representa la constante de absorbancia; n representa la relación de dilución; E representa el coeficiente de conversión (0, 50).
Cálculo de la actividad específica de la papaína:
Actividad específica de papaína/ (U·g-1) = actividad enzimática/contenido de proteínas
1. 3. 3 Método de análisis de datos El análisis de regresión utiliza el software SPSS 11.0 para analizar los datos.
1. 3. 4. Extracción ultrasónica mejorada de papaína. Tome una cierta cantidad de pulpa de papaya y utilice ondas ultrasónicas con una potencia de 200 W durante 100 y 20 segundos respectivamente.
0.
Tratamiento ultrasónico durante 300 y 400 s, luego se centrifugó y filtró para obtener una solución de muestra, y se midió el contenido de proteínas y la actividad enzimática.
El tiempo de tratamiento ultrasónico fue 200 Se utilizaron s y 100 s, 200, 300, 400, 500 W de potencia ultrasónica para procesar la pulpa de papaya, luego
centrifugar, filtrar y determinar el contenido de proteínas y la actividad enzimática.
Pesar una cierta cantidad. La pulpa de papaya se despulpó y se preparó en pulpas con diferentes fracciones de masa de 30, 40 y 50. La pulpa se trató ultrasónicamente a 200 W, 200 s y condiciones de baño de hielo, y luego se centrifugó y filtró para determinar el contenido de proteínas y la actividad enzimática.
Prueba ortogonal: con base en los resultados de la prueba de factor único, se seleccionó la tabla ortogonal L9 (34) para la prueba y se realizó el análisis de varianza. realizado para obtener los resultados de la mejora ultrasónica
Extracción de papaya Los parámetros óptimos del proceso de la proteasa.
1. 3. 5 Las propiedades enzimáticas de la papaína se midieron utilizando caseína como sustrato. En condiciones de pH 7,5, se tomó el líquido enzimático y el gradiente fue de 5 ℃ 30 -
La actividad enzimática se midió en un baño de agua a 90 ℃.
Usando caseína como. el sustrato, en condiciones de pH 7,5, la solución enzimática se separó en un gradiente de temperatura de 10 ℃. El baño de agua debe estar a una temperatura de 30 - 90 ℃
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Número 3 Xiao Guiping: Proceso de extracción ultrasónica de papaína y sus propiedades enzimáticas
Pasado el tiempo (5, 15, 30, 45, 60 min), sácalo, enfríalo y mide su actividad enzimática a 40°. C. Utilice la solución enzimática sin tratamiento térmico como control y como actividad enzimática original para calcular la actividad enzimática residual.
Utilice caseína como sustrato y utilice tampones con valores de pH de 4,8. , 5, 4, 6, 0, 6, 6, 7, 2 y 7, 8 respectivamente. Prepare la solución de sustrato y la solución de enzima diluida usando líquido para medir la actividad enzimática del sistema tampón: cuando el pH sea 3, 6 - 5. 8, utilice un sistema tampón 0, 02 mol·L - 1 HAC - NaAC cuando el pH sea 5, 8 -
8, un tampón 0, 02 mol·L - 1NaH2 PO4 - Na2HPO4. Se utiliza el sistema en diferentes condiciones de pH, incubar en un baño de agua a 40 ℃ durante 1 hora y luego medir la actividad enzimática.
Preparar KCl, NaCl, CaCl2, MgSO4, CuSO4, Soluciones reactivas de ZnCl2, EDTA, Cys y Vc con una concentración de 0. 025 mol·L - 1. respectivamente.
Tomar 9 mL de solución enzimática y mezclar y agitar con 1 mL del reactivo anterior. La concentración del reactivo es 0, 0025 mol·L - 1. Después de reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos, se utiliza caseína como reactivo.
El sustrato, bajo la condición de pH 7,5, mide su actividad enzimática relativa .
Utilice 20 mg·mL - 1 solución de caseína como solución madre para preparar un gradiente de contenido de 2 mg·mL - 1 2 - 14 mg·mL - 1 solución de sustrato
, reaccionar a 40 ℃, pH 7,5 durante 10 minutos, medir el valor de densidad óptica (que indica la cantidad de producto) y calcular Vo , encontrar la constante de Michaelis-Menten Km y la velocidad máxima de reacción Vm, y obtenga la ecuación de Michaelis-Menten.
Las condiciones óptimas del proceso de extracción son una potencia ultrasónica de 300 W y un tiempo de tratamiento ultrasónico de 200 s. La fracción de masa de pulpa es 30 después de una extracción mejorada mediante ondas ultrasónicas, la actividad enzimática aumenta; a 1,71 veces el original; con caseína como sustrato y pH 7,540°C, el valor de Km y Vm de la papaína son 1,4709 mg·mL - 1 y 5. 5252μg·mL - 1·min- 1; es 70 - 80 ℃, el valor de pH óptimo es 5, 4 - 6, 6; la enzima está por debajo de 40 ℃, el pH es 5, 4 - 6. La actividad de la enzima es relativamente estable en 0;
La actividad enzimática tiene un efecto activador, mientras que CuSO4 y ZnCl2 tienen un efecto inhibidor, mientras que KCl, NaCl, CaCl2 y MgSO4 tienen poco efecto sobre la actividad enzimática.
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