Instrucciones para PCR multiplex
La sensibilidad se puede analizar desde dos aspectos: la sensibilidad analítica (AS) y la sensibilidad clínica (CS).
La sensibilidad analítica (AS) enfatiza los resultados de la prueba: si la muestra contiene los elementos de la prueba, cuál es la probabilidad de éxito. En el contexto de una reacción de PCR, es el número de copias detectable más bajo. Una prueba que puede detectar una copia de un patógeno es claramente más sensible que una que requiere 10.000 copias para dar un resultado positivo.
La Sensibilidad Clínica (CS) analiza el problema desde una perspectiva clínica: qué tan exitoso es el resultado de la prueba en el diagnóstico del paciente.
Si una enfermedad tiene una sola causa, no existe diferencia entre la sensibilidad de detección y la sensibilidad clínica. Si el diagnóstico de una enfermedad requiere el análisis simultáneo de múltiples causas y solo detecta un indicador, la sensibilidad de detección será alta y la sensibilidad clínica se reducirá considerablemente. No hay dudas sobre la sensibilidad de qPCR, pero debido a que no puede realizar una detección múltiple, la sensibilidad clínica no es ideal. La sensibilidad clínica de la PCR múltiple es mucho mayor.
La PCR múltiple tiene una importancia clínica importante y amplias perspectivas de aplicación, pero todavía hay muchos factores limitantes. Entre ellos, la consistencia de la eficiencia de la amplificación de la PCR múltiple siempre ha sido el mayor problema. Cuantos más amplicones, más desigual. Cuanto mayor sea la eficiencia de amplificación, mayor será el grado. En respuesta a los problemas de la PCR multiplexada, muchas empresas de I+D biológicas en el mercado tienen sus propias estrategias y ventajas. Según el entendimiento del autor, Shanghai Yihe Biotechnology utiliza un software de diseño de cebadores de PCR multiplex desarrollado de forma independiente combinado con servicios de tecnología de optimización de PCR multiplex de conocimiento intensivo, y utiliza una tecnología única de modificación de grupos de cebadores para permitir que cientos de fragmentos amplificados se utilicen de manera efectiva en cebadores Amplificación, completa la modificación de grupos químicos. Los cebadores no se pueden combinar aleatoriamente. Los cebadores modificados se pueden aislar de otros cebadores, por lo que se pueden usar más cebadores. Por lo tanto, se pueden usar más cebadores en un sistema de PCR de un solo tubo y los grupos modificadores desaparecen después de la desnaturalización térmica. Además, durante el proceso de construcción de la biblioteca, los cebadores se etiquetan automáticamente con códigos de barras específicos de la muestra, lo que elimina la necesidad de construir una biblioteca secundaria.
El Dr. Xiao Junhua, consultor de Yihe Biotechnology, dijo que la tecnología de PCR multiplex de la compañía tiene una alta homogeneidad, el 90% de los amplicones alcanzan más de 15 lecturas, una gran especificidad y el 90% de las secuencias objetivo pueden alcanzarse. Los kits de construcción de bibliotecas combinados con esta tecnología son adecuados para la construcción de bibliotecas de enriquecimiento de varios instrumentos de secuenciación de alto rendimiento actuales, incluidos varios modelos y kits de PGM, Miseq e Hiseq. Nuestra tecnología de PCR multiplex se ha utilizado en diversos servicios técnicos basados en plataformas de alto rendimiento, como resecuenciación de secuencia objetivo, servicios de detección de SNP de alto rendimiento y servicios de detección de microsatélites de alto rendimiento (STR/SSR).
Diagrama de diseño de cebadores
En la era posgenómica, la gente tiene una demanda cada vez mayor de resecuenciación de regiones candidatas del genoma. La gente presta más atención a las secuencias que a unas pocas regiones candidatas. El rango puede estar entre 5 Kb y 100 Kb, y el costo de utilizar el método tradicional de Sanger o la secuenciación de captura por hibridación de la región objetivo es mayor. El uso de secuenciación de captura de la región objetivo por PCR múltiple es una buena opción. La PCR multiplex se utiliza para amplificar regiones genéticas completas y capturarlas en una sola pasada. Combinado con la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, se pueden secuenciar varias muestras al mismo tiempo, lo que reduce en gran medida el costo de examinar muestras de gran tamaño al mismo tiempo. Este método es adecuado para la detección y el diagnóstico de enfermedades genéticas mendelianas, la resecuenciación de regiones candidatas a GWAS, la resecuenciación de regiones cartográficas de QTL y la investigación y aplicación de la medicina de precisión.
El servicio de detección de SNP de alto rendimiento combina PCR múltiple y tecnología de secuenciación de alto rendimiento para diseñar cebadores específicos para los sitios que deben detectarse y realizar una amplificación por PCR múltiple en un solo tubo. Diferentes muestras utilizan diferentes códigos de barras. diferenciación de cebadores. Después de mezclar las muestras, los amplicones se secuencian en una plataforma de secuenciación. Los resultados de la secuenciación utilizan métodos bioinformáticos para distinguir diferentes muestras y finalmente obtener la información SNP de cada sitio. Este método es adecuado para la investigación genética con diferentes fines, como la investigación del genoma de enfermedades, la investigación del genoma de tumores, la investigación de asociaciones de genes y enfermedades, el diagnóstico molecular clínico, etc. En la investigación del genoma de las plantas, se puede utilizar para el mapeo de QTL y el mejoramiento molecular, y es muy adecuado para el análisis de SNP de muestras a gran escala.
En respuesta a la cuestión del precio, el Dr. Xiao dijo que actualmente, la mayoría de los productos de PCR multiplex de secuencia específica en el mercado utilizan tecnología LM-PCR y kits de construcción de bibliotecas de PCR multiplex de PCR mediada por ligación. El costo de construcción de la biblioteca LM-PCR es de 300 a 400 yuanes/muestra, mientras que el costo de la construcción de la biblioteca de PCR multiplex de Yihe Biotech es de aproximadamente 100 yuanes. El costo de construcción de la biblioteca PCR es de 100 yuanes por muestra.
La PCR multiplex no solo mejora la eficiencia o reduce los costos, sino que, lo que es más importante, sin multiplexación, la importancia clínica del diagnóstico molecular no es lo suficientemente grande como para ser utilizada ampliamente.
Yonghe Biotech también ha desempeñado un papel más importante en aplicaciones clínicas, desarrollando la eficacia de fármacos de quimioterapia y la detección del sitio relacionado con la toxicidad, la tipificación del virus de la hepatitis B y la detección de mutaciones YMDD, la detección de SNP relacionados con warfarina y la detección de SNP relacionados con cloro y pidogrel. y otros productos. Además, también hemos desarrollado y mejorado una variedad de servicios de genética molecular. Las plataformas de servicios más representativas incluyen pruebas de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de bajo, medio y alto rendimiento, detección de microsatélites (STR/SSR) de medio y alto rendimiento. construcción de fragmentos de amplificación por PCR multiplex de segunda generación, resecuenciación dirigida de segunda generación, detección de diversidad de variación del número de copias (CNV), identificación de antecedentes genéticos de ratón, expresión cuantitativa (MCF) de múltiples genes en la identificación celular) espere.