Cómo establecer métodos de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos
[Palabras clave] nuevos medicamentos; método de prueba de endotoxinas bacterianas; prueba de interferencia
[CCS] R927.12 [Código de identificación del documento] B [Número de artículo] 1673-7210 (2011) 11(b)-159-03
Cómo establecer métodos de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos
Xiao Guinan, Sun Qingping, Sheng Yingmei
Instituto Provincial de Guangdong para el Control de Drogas, Guangzhou 510180.
[Resumen] Propósito: Establecer un método de detección de endotoxinas bacterianas: Establecer un método de detección de endotoxinas bacterianas para nuevos fármacos. método. Detección de endotoxinas bacterianas en nuevos fármacos mediante el ensayo de lisado de células de Limulus. Resultado: este artículo presenta cómo establecer un método de detección de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Resultados: Este artículo presenta cómo establecer un método de detección de endotoxinas bacterianas para nuevos medicamentos, especialmente cómo determinar el límite de endotoxinas bacterianas y realizar la detección de interferencias. Conclusión Las pruebas de endotoxinas bacterianas proporcionan una base eficaz para el control de calidad y las pruebas de emergencia de nuevos medicamentos.
[Palabras clave] Nuevos medicamentos. Prueba de endotoxina bacteriana; prueba de interferencia
Es una tendencia general que la nueva prueba de endotoxina bacteriana medicinal reemplace la prueba de pirógenos en conejos, que tiene cierto valor en la respuesta de emergencia a accidentes relacionados con drogas y está en línea con el principio de las "3R". de experimentación animal a nivel internacional (optimización, reducción, coordinación). Esto también está en consonancia con el principio internacional de las "3R" de la experimentación con animales (optimización, reducción, sustitución). El método actual de detección de endotoxinas bacterianas es el método de prueba del cangrejo herradura establecido por los científicos estadounidenses Levin y Bang en 1968 [1]. A juzgar por la situación actual de la inspección de endotoxinas, algunas unidades no han podido realizar experimentos y diseños con referencia a los requisitos de la versión de 2010 de la Parte 2 de la Farmacopea China. Este artículo se centra en los problemas comunes que pueden ocurrir al establecer límites de endotoxinas bacterianas utilizando el método de inspección de endotoxinas bacterianas Estos dos aspectos, incluido el problema y la prueba de interferencia de endotoxinas bacterianas, se esfuerzan por proporcionar una referencia útil para el control de calidad y la inspección de emergencia de nuevos medicamentos.
1 Confirmación de los límites de prueba de endotoxinas bacterianas para medicamentos nuevos
1.1 Fórmula de cálculo para los límites de prueba de endotoxinas bacterianas
Los límites de prueba de endotoxinas bacterianas para medicamentos nuevos (L ) son la premisa y base para el establecimiento de toda la metodología. Actualmente, generalmente se determina de acuerdo con la Parte 2 del Apéndice 11E de la edición de 2010 de la Farmacopea China [2]. La fórmula de cálculo es L=K/M, K es la dosis máxima de endotoxina que el cuerpo humano puede aceptar por kilogramo de peso corporal por hora, en UE/(kg?h), K para inyecciones no radiactivas=5 UE/( kg?h), K=2,5 EU/(kg?h) para inyecciones radiactivas y K=0,2 EU/(kg?h) para inyecciones intratecales M es la dosis humana máxima del artículo de prueba por kilogramo de peso corporal por hora. . Un adulto pesa 60 kilogramos y tiene una superficie corporal de 1,62 metros cuadrados. Cuando las dosis de ciertos fármacos antineoplásicos y antibióticos se describen en términos de superficie corporal, la dosis por metro cuadrado de superficie corporal se puede convertir en dosis por kilogramo de peso corporal multiplicándola por 0,027. Se hace una comparación de referencia con los límites de endotoxinas de las cepas a granel en la Farmacopea de los Estados Unidos, la Farmacopea Británica, la Farmacopea Japonesa y la Farmacopea Europea) y los estándares de conversión o estándares de registro promulgados por la Administración Estatal de Alimentos y Medicamentos.
Otro método es hacer referencia a la dosis de inspección de pirógenos de la especie (puede considerarse como el valor M), porque la dosis de pirógenos generalmente se establece en 1 a 3 veces la dosis clínica para adultos, que es En el pasado, la práctica de comprobar la dosis con referencia a los pirógenos era bastante popular, pero ahora se utiliza cada vez menos.
1.3 Malentendidos comunes al calcular los límites de endotoxinas bacterianas
1.3.1 Confundir la dosis diaria promedio para adultos con la dosis máxima En la mayoría de los casos, las instrucciones o la información a menudo solo proporcionan una cierta cantidad. Dosis única o dosis diaria de un medicamento, en la práctica, muchas personas a menudo confunden la dosis única con la dosis máxima para calcular el límite, y el resultado es que el límite es obviamente demasiado amplio.
Como todos sabemos, excepto en algunos casos (medicación para pacientes agudos y graves), la dosis única se puede utilizar como dosis máxima. En la mayoría de los casos, después de convertir la dosis diaria en la dosis máxima, se necesita un cierto factor de seguridad. a considerar (generalmente de 3 a 10 veces).
1.3.2 Confundir la dosis diaria total con la dosis máxima por tiempo se basa únicamente en la dosis diaria total de un medicamento proporcionada en las instrucciones o información, sin considerar que el tiempo de infusión intravenosa del medicamento ha excedió con creces 1 La cantidad total de h, el valor límite derivado de esto es difícil de reflejar verdaderamente el valor límite real, porque el valor M refleja la dosis máxima del artículo de prueba que una persona puede aceptar por kilogramo de peso corporal por hora, en lugar de la dosis total a lo largo del día.
1.3.3 La determinación de los límites de endotoxinas bacterianas para grandes infusiones es demasiado paso a paso y no tiene en cuenta los requisitos especiales de las grandes infusiones. Los principales ingredientes farmacéuticos de las grandes infusiones sólo representan una parte. pequeña cantidad de la inyección de glucosa real o la inyección de solución salina normal en parte, si el límite de endotoxina bacteriana se calcula en función de los ingredientes principales del medicamento, es fácil ser demasiado amplio, por lo tanto, a menos que existan circunstancias especiales, la dosis de prueba de pirógenos. Se utilizarán 10 ml/kg como dosis clínica máxima, y la dosis clínica máxima se utilizará como dosis del producto de prueba, y será como la cantidad total del día.
1.3.4 Ignorar las endotoxinas bacterianas exógenas causadas por la infusión. Cuando algunos fármacos nuevos se utilizan clínicamente, se disuelven en soluciones intravenosas para infusión. Suponga que la especificación de un antibiótico es 1 g/tubo. Cuando lo use, disuélvalo en 250 ml de inyección de glucosa al 5% y gotee dentro de 1 hora. El límite de endotoxinas bacterianas de este antibiótico se puede calcular según el siguiente método, donde K = 5 EU/(kg?h), por lo que la endotoxina bacteriana máxima que un adulto de 60 kg puede recibir en el organismo por hora es de 300 EU. La endotoxina bacteriana máxima que se puede introducir en 250 ml de una inyección de glucosa al 5% en 1 hora es de 125 euros, y la endotoxina bacteriana máxima que se puede introducir en 1 gramo de este fármaco es de 175 euros (125-300 euros), por lo que esto El límite de endotoxinas bacterianas para los antibióticos se puede fijar en 0,175 ohmios/mg.
1.3.5 No se consideran ingredientes distintos del fármaco principal. En el proceso de determinación de los límites de endotoxinas bacterianas, especialmente para las materias primas, se debe prestar atención a deducir ingredientes distintos del fármaco principal (como el metal). iones) y endotoxinas bacterianas (el límite debe fijarse en 0,175 UE/mg: sodio en cefotaxima sódica, sodio en cilastatina sódica), porque la norma generalmente estipula que las endotoxinas bacterianas por mg de cefotaxima o cilastatina no deben exceder un cierto número de UE. , y las materias primas suelen contener sodio y otros ingredientes.
2 Prueba de revisión de susceptibilidad al reactivo de Limulus
2.1 Preparación preliminar
El equipo de prueba debe procesarse para eliminar posibles endotoxinas exógenas. Si se utilizan instrumentos de plástico, como placas de microtitulación y puntas de micropipeta, deben estar etiquetados como libres de endotoxinas y no interferirán con la prueba. Los instrumentos resistentes al calor se suelen retirar mediante esterilización con calor seco (250 °C, más de 30 minutos). Algunos elementos también se pueden retirar utilizando métodos apropiados que se haya confirmado que no interfieren con las pruebas de endotoxinas bacterianas (como los métodos de inmersión en ácidos fuertes y álcalis). ), pero se debe confirmar que no interferirán con la prueba de Limulus.
2.2 Prueba de revisión de sensibilidad
Cuando se utiliza un nuevo lote de reactivo de Limulus o los cambios en las condiciones de la prueba pueden afectar los resultados de la prueba, se debe realizar una prueba de revisión de sensibilidad del reactivo de Limulus. Cabe señalar que la inspección de endotoxinas bacterianas solo se puede llevar a cabo cuando la sensibilidad medida λc está entre 0,5λ y 2,0λ (donde 0,5λ ~ 2,0λ, λ es el valor etiquetado de la sensibilidad del reactivo de Limulus) y el La sensibilidad λ es el lote de reactivo de Limulus. Pruebas de rutina de sensibilidad del reactivo. Algunos inspectores utilizan erróneamente la sensibilidad medida real como la sensibilidad del lote de reactivos de lisado para pruebas diarias o pruebas de interferencia.
3 Prueba de interferencia de la prueba de Limulus
3.1 Confirmación de la dilución efectiva máxima (MVD)
MVD se refiere a la dilución máxima que la solución de prueba puede alcanzar en la prueba Múltiple, la fórmula de cálculo es MVD=C?L/λ, donde L es el límite de endotoxinas de la sustancia analizada y λ es la sensibilidad de etiquetado del reactivo de Limulus (EU/ml), o la sensibilidad del estándar. Reactivo de Limulus utilizado en el método fotométrico. L es el límite de endotoxina, λ es la sensibilidad de etiquetado del reactivo de Limulus (UE/ml), o la concentración de endotoxina más baja en la curva estándar utilizada en el método fotométrico, C es la concentración de la solución de prueba y C es igual a 1; Cuando L se expresa en EU/ml Cuando se expresa, es 0 si el producto de prueba es un polvo estéril para inyección o API, el MVD es 1, de modo que la concentración de dilución efectiva más baja del producto de prueba se puede calcular de acuerdo con C; = λ/L.
Aquí, el rango de sensibilidad del reactivo de Limulus generalmente se basa en el rango de sensibilidad de los reactivos disponibles comercialmente (0,03 ~ 1,00 EU/ml.) ~ 1,00 EU/ml) para calcular el rango de dilución de concentración efectiva del prueba de interferencia.
3.2 Prueba previa de interferencia
Tomar el producto 1 (la materia prima se pesa con precisión no menos de 10 mg), y según el límite de endotoxinas establecido, disolver la materia prima o la inyección. polvo en agua de prueba de endotoxinas y diluirlo a una serie de concentraciones que no exceda las regulaciones de MVD. La inyección se diluye directamente a la concentración de dilución efectiva mínima que no exceda la serie de concentraciones. Durante la prueba previa, se utiliza un reactivo de un fabricante. generalmente se usa. Durante la prueba previa, generalmente se usa un reactivo lisado de un fabricante. La sensibilidad es de 0,125 EU/ml o 0,250 EU/ml; realice una prueba de interferencia en la solución original del producto de prueba y sus diluciones en serie (control negativo). grupo (NPC) del producto de prueba), y se estableció un grupo de control positivo (PC) y un grupo de control negativo (NC), el grupo de control positivo del producto de prueba (PPC), se hicieron dos tubos en paralelo para cada concentración. y finalmente se obtuvieron los resultados finales del producto de prueba (número de lote: 20100802) a una concentración determinada e inferior, y los resultados se utilizaron para las pruebas de los artículos de prueba. La conclusión final es que el material de prueba (número de lote 20100802) en una concentración determinada e inferior no interfiere con la prueba de Limulus (la concentración donde "++" aparece por primera vez en el PPC). Los resultados de la prueba previa de interferencia de la solución de prueba se muestran en la Tabla 1.
Como se puede observar en la Tabla 1, la solución de prueba no tiene interferencia con la prueba del cangrejo herradura en una concentración no superior a 20 mg/ml.
3.3 Detección de interferencia formal
Prepare cada serie de soluciones de acuerdo con la Tabla 2, use soluciones que no deben detectar endotoxinas y no exceden el MVD, consulte las operaciones de prueba bajo la sensibilidad revisión del reactivo de Limulus y registro de la interferencia de la solución de prueba.
La prueba es válida solo cuando la solución de prueba y la solución de control negativo en el tubo paralelo son ambas negativas, y los resultados de la serie de control de sensibilidad etiquetados con reactivo LAL están dentro del rango de sensibilidad del reactivo LAL. y se calcula el control de sensibilidad etiquetado con reactivo LAL. La media geométrica (Es y Et) de las concentraciones finales de una serie de soluciones y una serie de reactivos que interfieren. Cuando Es está entre 0,5λ y 2,0λ y Et está entre 0,5Es y 2,0Es, se puede considerar que el material de prueba a esta concentración no tiene ningún efecto de interferencia. Si se interfiere con la prueba con una dilución menor que la MVD, la solución de prueba debe diluirse aún más hasta un nivel que no exceda la MVD y se debe repetir la prueba de interferencia.
Antes de la prueba de inspección de endotoxinas de nuevos medicamentos o al establecer métodos de inspección de endotoxinas para variedades sin elementos de inspección de endotoxinas, se debe realizar una prueba de interferencia cuando haya cambios en el reactivo del lisado, la prescripción del producto de prueba y el proceso de producción; o el entorno de prueba. Cuando se produzcan cambios que puedan afectar los resultados de la prueba, se debe volver a realizar la prueba de interferencia.
4 Métodos para eliminar la interferencia de las soluciones de prueba [3]
4.1 Método de dilución de la muestra
Seleccione un reactivo de Limulus con mayor sensibilidad para diluir aún más la muestra (baja La prueba de interferencia se realiza después de alcanzar la relación de dilución efectiva máxima. Generalmente, la mayoría de las interferencias se pueden controlar de manera efectiva.
Método de ajuste de pH 4.2
Al medir el valor de pH de la solución de prueba, si no está dentro del rango de pH del tampón efectivo del reactivo de lisado (6,0-8,0), un cierto Se puede usar una concentración de HCl o HCl para ajustar el valor del pH a 6,0-8,0, pero se debe prestar atención a la verificación del método (prueba de interferencia) para garantizar que no interfiera con la prueba de Limulus y no tenga impacto en la prueba de endotoxinas. resultados. Interferir con la prueba no afectará los resultados de la prueba de endotoxinas.
4.3 Ultrafiltración
A través de un sistema de ultrafiltración especial, se filtran pequeñas impurezas del fármaco que afectan la detección de endotoxinas, las endotoxinas se retienen en el filtro y se añaden las cantidades correspondientes al filtro. Se analiza el agua y se evita en la medida de lo posible la interferencia de fármacos de molécula pequeña sin afectar la concentración de endotoxinas.
4.4 Otros métodos
Método de calentamiento de mantenimiento de microtemperatura; utilice reactivo de Limulus que elimine el factor G o una solución especial anti-mejora proporcionada por el fabricante para diluir la muestra (se debe realizar una prueba de interferencia). realizado en este momento).
5 Pruebas de rutina
Utilice la dilución máxima efectiva (MVD) y la solución de prueba con interferencias eliminadas para preparar la solución de prueba y la solución de control positivo de la prueba para la detección de endotoxinas bacterianas. Pruebas de rutina.
6 Discusión
Para establecer un método de prueba de endotoxinas bacterianas para nuevas variedades de medicamentos, primero determine el límite de endotoxinas bacterianas según la dosis clínica máxima y utilice reactivos de Limulus de dos fabricantes para realizar la prueba. 3 lotes de muestras Inspección de prueba de Limulus (gel ordinario o prueba cuantitativa turbidimétrica dinámica), si se puede confirmar el resultado de la muestra, la concentración de la muestra en el factor de dilución efectivo máximo no es inferior al factor de dilución efectivo máximo de la bacteria prueba de endotoxinas y es consistente con la endotoxina bacteriana de la muestra. Las inspecciones de rutina no son disruptivas. Sin embargo, los resultados de las pruebas de endotoxinas bacterianas de rutina de las muestras son todos negativos, y sólo entonces se puede establecer el método de prueba de endotoxinas bacterianas para esta cepa [4-7].
Según la dosis clínica máxima y los resultados experimentales, el límite de endotoxinas bacterianas del nuevo fármaco en estudio se establece en menos de varios puntos de la UE por miligramo del fármaco principal (o por mililitro), y Se confirma mediante experimentos de interferencia que el nuevo fármaco a una determinada concentración y la siguiente (pero no menos que la concentración de dilución máxima efectiva MVC) no interfiere con las pruebas de endotoxinas bacterianas. Se extrajeron y probaron tres lotes de este producto de acuerdo con los estándares propuestos. Todos los resultados de las pruebas de endotoxinas cumplieron con las regulaciones.