Extracción y purificación de anticuerpos policlonales
I. Método de extracción por lotes
Pesar 50 g de DEAE-celulosa (DE32 o DE52), colocarlos en un vaso de precipitados de 1000 ml y dejar flotar con agua destilada. Primero, para partículas finas, utilice 0,01-0,05 mol/L de tampón fosfato (PB) alrededor de pH 8,0 para el tratamiento del equilibrio ácido-base. Drene o filtre el agua a través de un embudo filtrante Buchner (con dos capas de papel de filtro en su interior) para recoger la celulosa húmeda y reducir su fuerza iónica. Añadir 5 g de celulosa DEAE a 1 ml de suero, agitar bien y luego adsorber a 4°C durante 1 hora. El sobrenadante puede procesarse de esta manera para obtener IgG más pura. Este método es sencillo para extraer IgG y puede extraerse en pequeñas cantidades o prepararse en grandes cantidades.
II.Cromatografía de intercambio iónico Tris-Cl (Cromatografía de intercambio iónico)
Materiales y reactivos
1.Celulosa DE32 o DE52.
2.HCl; NaOH; 0,01-0,05 mol/L, pH 8,0 PB; pH 8,6 Tris-Cl;
3. Muestras a purificar: ascitis de hibridoma o sobrenadante de cultivo, suero inmune o extracto crudo saturado de sulfato de amonio.
4. Columna de cromatografía de 1,5×50 cm; bolsa de diálisis; espectrofotómetro UV y demás reactivos y equipos necesarios para diálisis y cromatografía.
Pasos operativos
1. Tratamiento de la celulosa DE52: Trate el DE52 con 0,01 mol/L, pH 8,6 Tris-Cl equilibrado con ácido y álcali.
2. Ensamble la columna cromatográfica: fije la columna cromatográfica en el soporte de titulación, coloque una gasa de nailon redonda en el fondo de la columna, conecte un tubo de plástico delgado a la salida y séllelo con agua. Vierta DE52 empapado en 0,01 mol/L, pH 8,6 Tris-Cl en la columna cromatográfica a lo largo de la varilla de vidrio. Cuando DE52 precipite naturalmente a una altura de 3 a 5 cm, succione 0,01 mol/L, pH 8,6 Tris-Cl. o Afloje la abrazadera en espiral de la salida de líquido, controle el caudal a 1 ~ 2 ml/min y agregue continuamente DE52 hasta la altura requerida. Después de que DE52 se haya asentado por completo, coloque un trozo de papel de filtro circular en el cilindro.
3. Equilibrio: Afloje la abrazadera en espiral de la salida de líquido, use 0,01 mol/L, pH 8,6 Tris-Cl para el equilibrio y controle el caudal a 15 gotas/minuto. los valores son los mismos.
4. Preparación de las muestras a extraer: Poner la proteína en una bolsa de diálisis, colocarla en un refrigerador a 4°C y dializar con 0,01mol/L pH8,6 Tris-Cl durante la noche.
5. Agregue la muestra, eluya y recoja: Use una pipeta para eliminar el líquido en la superficie de la columna y use una pipeta capilar para agregar la muestra a lo largo de la pared de la columna. La cantidad de muestra agregada es equivalente a 1. del volumen del lecho de la columna %~2%, la concentración de proteína es 50~70 mg. Abra la abrazadera en espiral en la salida, deje que la muestra ingrese lentamente al lecho de la columna y use una pequeña cantidad de eluyente para limpiar la pared de la columna cuando el líquido ingrese al lecho de la columna, eluya con 0,01 mol/L pH8,6 Tris-Cl; y luego lavar con una pequeña cantidad de eluyente. Durante la elución de Tris-Cl, controle el caudal de 14 a 16 gotas/min. Recoja en tubos separados, monitoree con UV o recoja manualmente en un espectrofotómetro UV para medir el valor de DO de 280 nm de cada tubo y representar el valor máximo del eluyente respectivamente.
6. Concentración: Combine la parte del pico superior de 280 nm OD del eluato y la parte del pico inferior de cada tubo respectivamente, colóquelos en una bolsa de diálisis y concéntrese hasta el volumen requerido con PEG.
El tercer método: cromatografía de intercambio iónico Tris-PO4
Este método se mejora ligeramente sobre la base del método anterior, es decir, utiliza elución en gradiente y puede usarse para IgG. e IgM en suero de extracción.
Materiales y reactivos
1.Celulosa DE32 o DE52.
2. Muestras a purificar: ascitis de hibridoma o sobrenadante de cultivo, suero inmune o extracto crudo saturado de sulfato de amonio.
3. Columna de cromatografía de 1,5×50 cm; bolsa de diálisis y otros reactivos y equipos de diálisis y cromatografía.
4: 0,005 mol/L, pH8,6 Tris-PO4; 0,055 mol/L, pH6,0 Tris-PO4;
Pasos de la operación
1. Dializar la muestra de proteína con 0,005 mol/L, pH 8,6 Tris-PO4.
2. Cargue DE52 en la columna y equilibre con 0,005 mol/L de Tris-PO4 a pH 8,6.
3. Agregue la muestra, eluya con 0,005 mol/L, pH 8,6 Tris-PO4 y realice un monitoreo UV hasta que el valor de DO de 280 nm del eluido vuelva a la línea base. Este paso elimina otras proteínas del suero.
4. Enjuague con 350 ml de Tris-PO4 0,055 mol/L, pH 6,0. Este paso se puede utilizar para purificar IgG e IgM séricas. La elución en gradiente se realizó con 125 ml de Tris-PO4 0,055 mol/l, pH 6,0, y 125 ml de Tris-PO4 0,5 mol/l, pH 5,1, recogiendo un total de 250 ml. Eluir y recoger un total de 250 ml; repetir el paso (5).
6. Combinar los picos de proteína de acuerdo con el pico de proteína de longitud de onda de 280 nm, dializar, concentrar y almacenar como se indica arriba.
Recupere el DE52 gastado mediante elución en gradiente con Tris-Cl 0,01 mol/L, pH 8,6 y NaCl 0,5 mol/L, Tris-Cl 0,01 mol/L, pH 8,6. Luego lavar con agua destilada hasta neutralidad, agregar azida sódica al 0,02% y almacenar a 4°C para su uso posterior.