Principios y pasos de los experimentos del WB

El experimento WB consiste en separar muestras de proteínas mixtas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y luego utilizar un sifón especial o un dispositivo de campo eléctrico para transferirlas a un soporte de fase sólida (como una membrana de PVDF). luego use una fase sólida. La proteína o péptido en el portador de fase sirve como antígeno.

Se une específicamente al anticuerpo primario correspondiente, para luego unirse a la enzima o anticuerpo secundario marcado con isótopos, y finalmente detecta el componente proteico específicamente relacionado con la expresión del gen diana mediante cromatografía de sustrato o cromatografía radiactiva. .

Preparación de muestras de proteínas

La muestra original pueden ser células, tejidos, sobrenadantes de cultivos, inmunoprecipitados o proteínas purificadas por afinidad. El siguiente es el método de procesamiento para la detección cualitativa de proteínas objetivo en muestras de células. Consulte la literatura relevante para conocer otros métodos de preparación de muestras.

1. Cultivo de células o tratamiento farmacológico.

2. Deseche el medio de cultivo y lave las células dos veces con 1X PBS para eliminar el medio de cultivo restante.

3. Agregue tampón de muestra 1X SDS, raspe las células y transfiéralas al tubo Ep. NOTA: Opere sobre hielo.

4. Ultrasónico durante 10 ~ 15 segundos para cortar el ADN y reducir la viscosidad de la muestra.

5. Hervir la muestra durante 5 minutos.

6. Centrifugar a 12000g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.

Electroforesis SDS-PAGE

I. Limpieza de la placa de vidrio

II. Aplicación y carga del gel

1. Alinear la placa de vidrio Y colóquelo en el clip y apriételo. Luego fíjelo verticalmente al estante y prepárese para pegarlo.

2. Preparar gel de separación al 10%, agitar bien y añadir gel TEMED inmediatamente. Al verter pegamento, puede utilizar una pistola rociadora de 10 ml para aspirar 5 ml de pegamento y soltarlo a lo largo del vidrio hasta que la superficie del pegamento se eleve a la altura de la línea central de la cinta verde. Luego agregue una capa de agua al pegamento. Geles selladores líquidos más rápido.

3. Cuando aparecen líneas de refracción entre el agua y el pegamento, significa que el pegamento se ha solidificado. Espera otros 3 minutos para que el pegamento se solidifique por completo, luego vierte la capa de agua sobre el pegamento y absorbe el agua con papel absorbente.

4. Prepara la gelatina concentrada del paso 4, agrega TEMED y agita inmediatamente para llenar la gelatina. Llena el espacio restante con concentrado, insertando el peine en el concentrado. Después de que el concentrado de gel se haya solidificado, sostenga ambos lados del peine con ambas manos, apúntelo verticalmente hacia arriba y tire suavemente del peine.

5. Enjuague el gel concentrado con agua y póngalo en el tanque de electroforesis.

6. Agregue 1 × tampón de electroforesis Tris-glicina o SDS a los tanques superior e inferior del tanque de electroforesis respectivamente y cargue la muestra.

7. Conecte el tanque de electroforesis al instrumento de electroforesis. Conecte el tanque superior al electrodo negativo y el tanque inferior al electrodo positivo. El voltaje de inicio es de 70-80 V, y el voltaje es de 100 V durante 2 horas. el azul migra a 1 cm del fondo y se detiene la electroforesis.

Transferencia

1. Remojar el gel en tampón de transferencia y equilibrar durante 10 minutos. Nota: Si está detectando proteínas de moléculas pequeñas, este paso se puede omitir porque las proteínas de moléculas pequeñas pueden difundirse fácilmente fuera del gel.

2.

2. Cortar 6 trozos de membrana y papel de filtro según el tamaño del gel, y equilibrar en el tampón de transferencia durante 10 minutos. Si utiliza una membrana de PVDF, satúrela con metanol puro durante 3 a 5 segundos.

3. Ensamble la capa intermedia de transferencia: 3 capas de membrana de papel de filtro de esponja y 3 capas de papel de filtro de esponja. Después de colocar cada capa, use un tubo de ensayo para eliminar las burbujas de aire. Recuerde: el pegamento debe aplicarse por el lado negativo (lado negro).

4. Coloque el baño de transferencia en un baño de hielo, coloque el sándwich (ponga el lado negro sobre el lado negro), agregue el tampón de transferencia, inserte el electrodo, 100 V, 1 h (la corriente es de aproximadamente 0,3 A). ).

5. Una vez completada la transferencia, corte la energía y retire la membrana de hibridación.

Bloqueo e Hibridación

1. Lavar la membrana con 25ml TBS durante 5 minutos a temperatura ambiente y agitar bien.

2. Colocar la membrana en 25 ml de tampón de bloqueo y agitar a temperatura ambiente durante 1 hora.

3. Lavar la membrana 3 veces con 15ml TBS/T (5min/T).

4. Añadir el anticuerpo primario de la dilución adecuada e incubar a temperatura ambiente durante 1-2 horas o durante la noche a 4°C con agitación lenta.

5. Lavar 3 veces con 15ml TBS/T (5min/T).

6. Agregue el anticuerpo secundario adecuadamente diluido marcado con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano picante (HRP) e incube durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación lenta.

Lavar 3 veces con 7,15 ml TBS/T (5 min/T).

Lavar una vez con 8,15 ml de TBS. Enjuague ligeramente la película con agua desionizada, coloque papel de filtro en una esquina de la película para absorberla, luego use el método de pegado inverso para cubrir la película con gotas mezcladas de A y B. Apague la luz hasta que la banda fluorescente verde claro pueda desaparecer. se verá (aproximadamente 5 minutos), luego coloque el papel de filtro en una esquina de la película para absorberlo en seco, luego use el método de pegado inverso para cubrir las gotas mezcladas de A y B en la película, apague la luz hasta que la luz Se puede ver una banda verde fluorescente (aproximadamente 5 minutos) y luego coloque el papel de filtro. Seque una esquina de la película, fíjela en la caja con una envoltura de plástico, cubra rápidamente la película, cierre la tapa de la caja y exponga de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia.

Saca la película y sumérgela inmediatamente en el revelador durante 1 a 2 minutos. Enjuágala con agua y ponla en la solución fijadora hasta que la película esté completamente fijada. Enjuágala con agua y sécala. Calibre el marcador y analice el escaneo.

Problemas comunes y soluciones en WB.

1. Intensidad de señal baja

La intensidad de señal baja significa que la banda objetivo obtenida en condiciones de exposición normales es muy pequeña o no tiene banda objetivo. Aumentar el tiempo de exposición provocará un fondo alto. y ruido. Trayendo demasiado y otros problemas. Las principales razones de estos problemas son las siguientes:

1) Falta de expresión de proteínas en la muestra. Se recomienda agregar una línea celular con mayor expresión proteica como control positivo, o aumentar la cantidad de muestra para obtener un mayor grado de señal;

② Degradación de proteínas. Durante la preparación de muestras de proteínas, preste atención al uso del inhibidor de proteasa PMSF, y las muestras preparadas deben analizarse lo antes posible o almacenarse adecuadamente;

③Las proteínas abarcan membranas. Utilice una membrana con un tamaño de poro adecuado y optimice el tiempo de transferencia. Es posible que se requieran tiempos de transferencia más largos para proteínas de alto peso molecular.

④ Uso de anticuerpos. El tipo de reacción del anticuerpo y el tipo de experimento deben satisfacer las necesidades del experimento. Además, cuestiones como la proporción de dilución y el tiempo de incubación del anticuerpo también deben optimizarse de vez en cuando durante el experimento;

⑤La tasa de separación de proteínas y anticuerpos es baja. Reduzca el número de lavados de membrana o acorte el tiempo de lavado de membrana, reduzca la concentración de NaCl en la solución de lavado de membrana, etc.;

⑥ El antígeno está cubierto por la solución bloqueadora. Cambie a una solución de bloqueo diferente, optimice la concentración de proteínas en la solución de bloqueo y acorte el tiempo de bloqueo;

7 La concentración de metanol es demasiado alta. Hará que las proteínas se separen del SDS y precipiten en el gel, lo que provocará que el gel se encoja o se endurezca, inhibiendo así la transferencia de proteínas de alto peso molecular. En el experimento, la concentración de metanol se puede reducir adecuadamente o reemplazar con etanol, alcohol isopropílico, etc.

2. Bandas no específicas o posiciones de banda incorrectas

Las bandas distintas a la banda objetivo en los resultados del WB se denominan bandas no específicas. A veces las bandas no específicas son muy. Es obvio, pero sin la banda objetivo, estas situaciones pueden causar una interferencia significativa en el análisis de los resultados. En términos generales, los principales factores que causan estos problemas son:

① Separación inespecífica de anticuerpos. En general, se cree que los polianticuerpos son menos específicos que los anticuerpos individuales y son propensos a producir bandas no específicas. Reducir adecuadamente la concentración de anticuerpos puede ayudar a reducir las bandas híbridas. Al mismo tiempo, para eliminar la posibilidad de una separación no específica por parte del anticuerpo secundario, se recomienda configurar un control negativo del anticuerpo secundario;

② La cantidad de proteína de la muestra es demasiado alta. Reducir adecuadamente el volumen de inyección y extender el tiempo de lavado y bloqueo puede prevenir los efectos adversos del alto contenido de proteínas en los resultados;

③Degradación de las proteínas. La degradación de las proteínas provocará cambios en la posición de las bandas y producirá bandas más heterogéneas. Se recomienda utilizar muestras recién preparadas o muestras con menos ciclos de congelación y descongelación.

4) Demasiados pases celulares. Conducirá a la diferenciación de las formas de expresión de proteínas, se recomienda utilizar líneas celulares originales o menos;

⑤ La presencia de complejos proteicos.

Algunas proteínas diana se separarán y formarán complejos con otras proteínas, lo que provocará cambios en la posición de la banda. Es necesario consultar la literatura relevante para determinar si la proteína puede formar un complejo estable;

⑥ Hay empalme o múltiples. modificaciones a la proteína. Algunas proteínas tienen sitios de escisión y algunos cuerpos de escisión son inmunorreactivos y pueden detectarse en WB. Además, algunas proteínas diana pueden tener sitios de glicosilación u otros sitios de modificación, y el tamaño de la banda puede exceder con creces el peso molecular teórico. Por lo tanto, es necesario consultar la literatura o uniprot para comprender el tamaño del espliceosoma y los sitios de modificación de la proteína.

En tercer lugar, el fondo es demasiado alto

En algunos resultados de WB, el fondo que debería estar en blanco fuera de la banda también será más oscuro, lo que interferirá con los resultados del análisis y hará que la imagen del resultado sea más oscura. antiestético y difícil de analizar. Se utiliza para la publicación de artículos. Las posibles razones de este problema son las siguientes:

①Blindaje insuficiente. Una de las principales razones del alto nivel de fondo son los problemas de bloqueo. Se deben utilizar de forma proactiva agentes bloqueantes apropiados (leche desnatada en polvo, BSA, etc.) para optimizar la concentración de reactivos. ), optimizar la concentración de reacción y el tiempo de bloqueo, y prestar atención para evitar la reacción cruzada entre el anticuerpo y el agente bloqueante, así como la contaminación del agente bloqueante con el antígeno objetivo, biotina endógena o con avidina/estreptavidina. como insolubilidad de la hexina;

② Lavado insuficiente de la membrana. Aumentar adecuadamente el número de lavados de la membrana, el volumen del tampón de relajación y aumentar la proporción de Tween 20 puede mejorar el fondo alto causado por un lavado insuficiente de la membrana;

③Uso de anticuerpos. La concentración excesiva de anticuerpos primarios es una de las razones del fondo alto y el anticuerpo secundario también puede causar una separación no específica del agente bloqueador. Por lo tanto, se recomienda optimizar la concentración de anticuerpos primarios y configurar un control negativo de anticuerpos secundarios. /p>

④ Exposición demasiado larga. Se recomienda utilizar tiempos de exposición adecuados en los experimentos.

4. Las tiras están dispersas o tienen formas extrañas.

A veces, la posición de las tiras en el mapa de resultados de WB es la esperada, pero no se puede utilizar debido a factores como tiras dispersas y formas extrañas. Esto se debe principalmente a problemas con la producción del gel o el proceso de electroforesis, como se indica a continuación:

① El voltaje y la corriente excesivos durante la electroforesis harán que la movilidad de la banda sea demasiado alta.